大黄鱼弧菌病研究——病原生物学及免疫学研究

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1、将副溶血弧菌培养至对数生长期,用天然海水洗脱,调整菌浓度至107cells/mL左右后置于28℃恒温培养箱进行饥饿试验。结果表明:在饥饿初期细菌总数、CFU和活菌数都有较大幅度上升;在饥饿中、后期,细菌总数、CFU和活菌数都呈下降趋势,其中总菌数与活菌数缓慢下降,而CFU数降低速度较快。结晶紫染色观察的结果表明:饥饿前副溶血弧菌呈短杆状,染色均匀;饥饿后许多细胞中央出现染色较浅的区域,而且细胞形态也变为椭圆形。以对数生长期的副溶血弧菌为对照,对饥饿60d的副溶血弧菌进行热处理和紫外线处理。结果表明饥饿60d的副溶血弧菌对热和紫外线更敏感。用间接ELISA测定饥饿前后副溶血弧菌的最低检测限,饥饿60d的副溶血弧菌的检测限略低于饥饿前。采用细菌计数法测定不同饥饿时期副溶血弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附情况,结果表明溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附量随着饥饿时间延长而急剧下降,饥饿7d后的粘附量接近于空白。提取副溶血弧菌的全蛋白,用SDS-PAGE分析不同饥饿时期蛋白质的差异,结果表明:饥饿30d后菌蛋白质条带比饥饿前的蛋白质条带少;饥饿60d后蛋白质条带比饥饿30d后菌蛋白质条带又有所增加,但比饥饿前少。 2、采用荧光标记计数法测定溶藻弧菌的粘附作用。结果表明溶藻弧菌对大黄鱼肠粘液的粘附量随菌浓度的升高而升高并在1~1.5h内趋于饱和;粘附作用在温度15~30℃、pH偏酸时较强;盐度在5~35范围内对前肠粘液的粘附作用影响不明显,后肠粘液的粘附作用在此范围内随盐度增大而加强,在盐度为0时,溶藻弧菌对前、后肠粘液都无粘附作用;56℃热处理5min及60℃处理1h均能大幅减弱溶藻弧菌对两种肠粘液的粘附作用,表明溶藻弧菌表面的某些热敏结构在粘附作用中起着重要作用。根据以上结果可以认为溶藻弧菌能够很好地粘附于大黄鱼肠粘液层,其粘附作用受温度、盐度、pH值等环境因子影响很大,溶藻弧菌表面的某些热敏结构可能在粘附过程中起着重要作用。 3、采用3H-TdR同位素示踪方法研究了环境因子对溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液粘附作用的影响。试验结果表明溶藻弧菌能很好地粘附于大黄鱼表皮粘液,其粘附量在菌浓度不超过6.52×108cfu/ml情况下随菌浓度的升高而升高;粘附量在25℃下孵育180min趋于饱和,在180min以内与孵育时间呈正相关关系;粘附作用在温度25~30℃、pH偏酸、盐度35条件下较强;在盐度为0时,无粘附作用;Ca2+能显著加强溶藻弧菌的粘附作用,而Mg2+作用不明显;溶藻弧菌经营养饥饿、热处理、抗体处理、蛋白酶及高碘酸处理后粘附作用有明显下降;在8种碳水化合物的干扰下溶藻弧菌的粘附作用会有一定程度的变化,其中葡萄糖、果糖、甘露糖能明显促进溶藻弧菌的粘附作用;溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液中较大分子量的物质有较强的亲和力。这些结果表明溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用,其粘附作用受温度、盐度、pH等环境因子的影响,溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液存在特异性粘附作用,这种粘附与细菌活力,其表面的蛋白类、糖类等物质以及粘液的化学组成都有密切关系。 4、分别用饱和硫酸铵二次盐析法和蛋白A亲和层析法对健康大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)血清中的免疫球蛋白(IgM)进行分离纯化,所得产物用SDS-PAGE进行检测。结果表明:蛋白A亲和层析法可以较好地分离到高纯度的大黄鱼血清IgM,产物的电泳胶中只有重链和轻链2个条带;饱和硫酸铵二次盐析法除了有这2个条带,还有很多杂带,而且蛋白A亲和层析法更为简便、快速,因此用蛋白A亲和层析法分离纯化IgM优于饱和硫酸铵二次盐析法;大黄鱼免疫球蛋白重链的分子量在76kDa左右;轻链分子量在28kDa左右。用纯化的大黄鱼IgM免疫实验兔,获得效价高达1∶40960的兔抗鱼IgM血清。本文所建立的蛋白A亲和层析法提取大黄鱼血清IgM可以方便、快捷地获得高纯度的产物,适合在实验室中纯化鱼类IgM。 5、用浓度为2×106cfu/ml的溶藻弧菌通过背部肌肉注射感染大黄鱼,每尾大黄鱼注射0.2ml,对照组大黄鱼每尾注射0.2ml灭菌生理盐水,注射后第1天、第2天、第4天、第8天、第12天、第16天、第20天取两组大黄鱼各6尾,从尾静脉取血,进行各项免疫学指标检测。结果显示:感染组的抗菌活力在第2天至第8天中比对照组显著增高(P<0.05),且感染组的抗菌活力在第8天达到峰值,达58.6±4.1﹪;感染组的ELISA和试管凝集反应结果显示抗体效价均在第16天达到峰值;感染组ACP活力在第12天比对照组显著性低(P<0.05);感染组SOD活力与对照组在各时相均无显著性差异(P>0.05)。
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