研究背景巨型囊泡（Giant vesicle,GV）是一种直径在1～100μm的球形脂质囊泡结构,因其尺寸和膜结构与细胞相似,作为细胞及细胞膜模型被广泛用于模拟细胞大小隔室、膜行为以及功能等研究。电形成法是GV制备最常用的的方法之一,但是在离子浓度高于50 mmol/L的溶液条件下很难有效产生GV,这极大限制了电形成法在生理盐水等高浓度离子溶液条件下的应用。研究发现,离子主要通过对脂质膜的影响和电场的干扰两个方面来影响GV的产生。目前,已有一些研究针对离子对脂质膜的影响,通过改变脂质膜的组成或改良涂层的基底,成功在高浓度离子溶液中电形成制备GV。本文针对离子对电场的干扰,拟对传统电形成装置进行改良,并优化脂质涂膜参数和电场参数,建立生理盐水溶液条件下高效制备GV的方法,同时探讨改良机制,为高浓度离子溶液中GV模型制备的研究提供实验技术和理论基础。目的通过改良传统电形成装置和参数优化,建立适用于生理盐水中高效制备GV的装置和方法。方法1.通过在传统聚四氟乙烯板框架腔室区域增加绝缘隔膜,制得改良聚四氟乙烯框架,再将其组装在两片氧化铟锡（Indium Tin Oxide,ITO）电极之间,形成改良电形成装置。通过对比改良装置和传统装置分别在去离子水和生理盐水中电形成制备GV的数量和直径分布,以判断改良是否成功。2.通过观察传统电形成装置中去离子水和不同浓度Na Cl溶液中GV的形成,研究溶液离子浓度与GV形成的关系;再分别测量去离子水和不同浓度Na Cl溶液的阻抗值,确定溶液离子浓度与阻抗的关系;最后对比装置改良对溶液中电极间阻抗的影响,并理论模拟分析溶液阻抗对电极间电场强度的影响,分析改良装置促进高浓度离子溶液中GV电形成的可能机制。3.使用脂质双层膜荧光探针（3,3’-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate,Di O）标记的二棕榈酰磷脂酰胆碱（Dipalmitoyl phosphatidylcholine,DPPC）磷脂,以不同DPPC浓度（5 mg/m L、10mg/m L、20 mg/m L）,不同体积（5μL、10μL、20μL、40μL）,不同温度（25℃、35℃、45℃）下在ITO电极表面涂膜,通过荧光显微镜观察分析脂质的沉积和均匀性,优化电极表面制备脂质膜的参数。4.使用改良的电形成装置,在优化参数下制备DPPC涂层,对比不同加电时间（1h、3h、5h）,不同频率（10 Hz、100 Hz、1k Hz、10 k Hz、100 k Hz）,不同电场强度（2.5 V/mm、5 V/mm、7.5 V/mm、10 V/mm）等参数下,在生理盐水中制备GV的形态数量和直径分布等变化,对电场参数进行优化。结果1.对传统电形成装置的腔室进行绝缘分隔,成功改良电形成装置。在同样的电场参数和条件下,去离子水中传统装置形成大量光镜可见的球形囊泡结构,为直径超过5μm的GV,改良装置电形成样品中,同样可见数量和形态相似的GV;在生理盐水中制备时,传统装置中几乎没有光镜可见的GV形成,但是在改良装置中则可见数量较多的GV产生。2.在传统装置中,低浓度（0～0.0009%）Na Cl溶液中GV的形成随着Na Cl浓度的增加而降低,当Na Cl浓度升高至（0.009%～0.9%）后GV形成量显著降低。Na Cl溶液的阻抗值随着Na Cl浓度的降低而增大,在传统电形成装置的电极间,40Hz频率下检测到生理盐水的阻抗为200Ω,去离子水的阻抗值大约在10 MΩ,显著高于生理盐水溶液;在改良电形成装置的两个电极间,去离子水和生理盐水的阻抗值无显著差异,都超过10 MΩ。模拟计算结果表明,随着溶液阻抗的减小,两电极间的电场强度逐渐减小。3.以5～20 mg/m L浓度范围的DPPC在ITO电极表面涂膜,随着DPPC浓度增加,脂质膜总体荧光强度逐渐增加;在较低浓度（5～10mg/m L）时荧光分布较均匀;在20 mg/m L浓度时,出现‘波浪状’不均匀膜层。在5～40μL范围内,随着涂膜体积的增加,脂质膜总体荧光强度逐渐增加;在体积在5～10μL时,镜下荧光分布较均匀;体积进一步增加至20μL,脂质涂层有开始出现成块的“结晶状”改变;当体积增加到40μL时,出现‘蜂窝状’不均匀膜层。在不同温度下涂膜,在25℃下,荧光分布较均匀;温度在35℃时,镜下荧光无明显变化;温度为45℃时,脂质涂层开始出现较多黑色未成膜区域。4.在生理盐水中使用改良装置在不同参数下电形成制备GV,以2.5 V/mm和10 Hz加电1～3 h的样品中均可见大量球形结构GV;5h后GV数量明显下降。在2.5 V/mm电场强度下加电4h,五组频率（10Hz、100 Hz、1 k Hz、10 k Hz、100 k Hz）都有形成GV,在低频范围10Hz～1 k Hz,随频率增加囊泡形成数量增加,形态较好;当频率大于1 k Hz后,囊泡形成量减小。以频率1k Hz加电4 h,在电场强度2.5～10 V/mm的范围内GV电形成随着电场强度的增大,数量先增加,在5 V/mm处达到最大值;进一步增加电场强度,GV直径明显变小,在电场强度为10 V/mm时,镜下GV形态差,出现大量脂质碎片。结论通过在两个电极腔室之间增加绝缘隔膜对传统电形成装置进行改良,增加电极间阻抗,使被离子减弱的电场强度恢复,从而成功地促进了GV在生理盐水中的电形成。以DPPC浓度为5～10 mg/m L,涂膜体积为10μL,涂膜温度为35℃条件下获得均匀的脂质膜,在改良装置中以1 k Hz、5 V/mm的电场参数可在生理盐水中获得较好的电形成制备效果。