论文部分内容阅读
受益于非侵入性、高分辨率、实时可视化及快速反馈的固有优点,荧光成像技术已成为研究生理及病理学过程的重要手段。相较于可见光区(400-700 nm)及近红外一区(NIR-I,700-900 nm)波段的荧光成像,近红外二区(NIR-II,1000-1700 nm)窗口荧光成像具有更高时空分辨率、更强组织穿透能力及更低光散射和组织自发荧光,因而更适用于活体分析。作为近红外二区成像的关键组成部分,近红外二区发光材料的本身特性决定了其应用前景。有机小分子染料以其易于修饰、结构灵活及良好的生物安全性等优势,具有进一步临床转化的潜力。然而,当前报道的近红外二区分子成像试剂多为常亮型(“always on”)。它们对疾病区域的传感及成像通常依赖于荧光分子的积累和保留,而不是对病理微环境特异性识别/响应,因而成像背景信号高,对比度低,影响诊断和治疗结果的准确性。此外,为获取高的活体成像对比度,常亮型荧光试剂通常需要经过较长时间机体循环以代谢掉多余或脱靶的染料,这种被动的操作模式增加了成像的难度,降低了成像的可操控性,不利于生物学过程的动态监测。可被生物标志物特异性激活的NIR-II分子荧光探针能够提供更高的成像信噪比和原位生化信息,对在活体水平上进行组织造影,生物学过程的成像分析及探究意义重大,是一种比常亮型荧光造影剂更有潜力的新型荧光造影剂。然而,作为一种新兴领域(迄今为止才发展3年),可激活型NIR-II荧光探针发展面临一些亟待解决的科学问题。首先,由于构建新型NIR-II荧光团难度较大及经典的可激活探针的设计机理在NIR-II范围内适用性受限,激活型NIR-II荧光探针的数量十分稀少且激发/发射波长较短(λabs<900 nm,λem(900-1000 nm)),没有发挥出NIR-II荧光探针在成像对比度及穿透深度等优势。第二:已报道的可激活型NIR-II分子探针均为单一生理/病理参数响应激活,在复杂且动态的机体环境中不仅会引起非特异性靶向激活的问题,甚至会导致“假阳性”信号产生,影响成像结果的准确性。综上,本论文首先从发展新型NIR-II分子荧光团入手,通过合理的分子设计策略及精准结构调控,以机体生理及病理学指标为研究对象,设计并合成多种新型可激活的NIR-II荧光探针来解决当前面临的数量稀少,发射波长有限及单靶标激活带来的非特异性响应等问题,最后结合活体成像系统实现小鼠活体水平疾病实时监测、精准诊断及治疗。具体内容分为以下几个部分:1:基于BODIPY骨架构建新型NIR-II分子荧光团。我们首先选择具有高稳定性及易于修饰的氟硼吡咯类(BODIPY)衍生物作为分子母体荧光团,并在BODIPY母体3号位点引入不同基团(硫醚,烷基,氨基,哌啶等)合成具有不同电子密度的能量供体。随后,选择具有强拉电子能力的酰萘胺正盐为受体基团,并通过Knoevenagel缩合反应构建出五种基于BODIPY骨架且具有D-π-A结构的新型荧光团,并分别命名为WD-S-C4H6O2、WD-Cl、WD-C2H5、WD-NHCH3、WD-CH3。实验结果表明,强给电子能力哌啶取代基的引入增强了WD-CH3荧光团分子内推拉电子效应,成功地将荧光团发射波长延伸至NIR-II窗口(08))8(6)1024 nm)。同时,荧光团WD-CH3不仅具有大Stokes位移(超过200 nm)及较高的摩尔吸光系数(3.66×10~4M-1cm-1),还具有良好的化学稳定性和光稳定性,使WD-CH3具备了作为构建可激活NIR-II荧光探针的潜力。2.基于共轭结构调控机理的NIR-II粘度探针的构建及粘度相关疾病的成像应用。原则上,具有D-π-A结构分子供受体间柔性连接键会随粘度环境的改变影响分子的共轭结构及能量跃迁方式从而产生粘度相关荧光响应。受此启发,我们以上章中得到的NIR-II荧光团WD-CH3为基础构建粘度激活探针。同时,为进一步探究分子构型与粘度响应灵敏度的关系,我们在BODIPY荧光团邻位引入不同取代基(吸电子硝基,给电子甲氧基及氨基)构建了一系列粘度激活NIR-II发射的分子探针(WD-X,WD-CH3,WD-NO2,WD-OCH3,和WD-NME2)。筛选结果表明,由于具有最大的可旋转二面角,硝基取代的分子探针(WD-NO2)表现出最高的响应灵敏度(982 nm处荧光增强31倍),同时还具有对其他机体内环境(如p H、极性等)不敏感及量子产率相对较高(甘油中为1.6%)等优点。最终,作为首个粘度激活的NIR-II荧光探针,WD-NO2成功地用于原位成像药物介导的肿瘤细胞凋亡及糖尿病诱发肝损伤等病理过程中粘度变化。3:灵活的分子设计策略来构建最大发射波长超过1200 nm的可激活NIR-II荧光平台。荧光分子发射波长是探针领域备受关注的前沿课题。通过减弱光子散射及机体组织自荧光,更长的波长发射能提供更高的成像对比度和更深的组织穿透能力。然而,当前可激活NIR-II型荧光探针数量有限、发射波长多处于900-1000 nm,不能完全体现NIR-II成像优势,因此构建具有更长发射波长(>1200 nm)的可激活NIR-II荧光平台意义重大。对当前的调控波长红移的策略进行详尽评估后,我们认为恰当地延伸分子的共轭结构及提高供体的给电子能力是红移波长的有效策略。为此,在本工作中,我们仍选择BODIPY作为母体荧光团,并将延长分子π共轭区域和增强供体的电子密度整合到一个系统中,同时联合分析物刺激响应前后推挽电子效应改变的策略构建了四个概念验证性探针(WH-1、WH-2、WH-3和WH-4)。这些探针可以被结肠癌标志物H2S特异性激活,并在延长π共轭体系和增强供体电子能力的协同作用下实现最大发射从925 nm至1205 nm的红移。通过筛选,探针WH-3表现出长激发/发射(925/1140 nm),可接受荧光量子产率及对H2S高灵敏度响应的最佳组合。最终受益于NIR-II/IIa成像的深层穿透及高时空分辨的优点,WH-3能够实现结肠癌组织内H2S的实时监测及高对比度成像。更重要的是,该工作为构建长波长可激活NIR-II荧光探针提供了通用平台,即通过灵活调节识别位点便能构建各种生物标志物响应的探针。4.基于“双锁双钥匙”策略NIR-II分子探针用于特异性识别原位结肠癌和成像引导的肿瘤切除。受益于高时空分辨率和深层组织穿透能力,NIR-II荧光成像已成为一种很有前途的肿瘤诊断工具。然而,现阶段已开发的大部分可激活型NIR-II探针的肿瘤学应用还主要局限于较浅深度的皮下肿瘤成像,无法实现深层次的肿瘤成像。其主要原因在于:目前可用的NIR-II成像剂基于“始终开启”模式或单一生物标志物激活,活体成像受到有限的对比度、非特异性激活,甚至假阳性诊断的影响。为解决上述问题,在本工作中,我们基于BODIPY荧光团首次开发了H2S/H+双刺激响应NIR-II荧光探针WH-N3,使其用于精准定位原位结肠肿瘤和荧光引导的肿瘤切除手术。实验结果表明,探针本身在NIR-II无荧光发射,其仅有在H2S和肿瘤酸性环境(TEM)的协同激活下才能发出NIR-II荧光信号。受益于“双锁双钥匙”的激活策略,探针(WH-N3)在硫化氢过表达的结肠癌成像中表现出比“always on”造影剂(ICG)和单H2S响应探针(WH-1)更高的肿瘤与正常组织(T/N)信噪比(分别为6.5及3.5倍)。同时,WH-N3还能够可视化肿瘤内源性H2S波动,并根据H2S含量差异准确区分肿瘤类型。最终,在NIR-II荧光的引导下,探针实现了对微小原位结肠肿瘤(直径低于0.8 mm)的特异性识别和精准切除。