【背景与目的】哮喘是一种高度异质性的慢性呼吸道炎性疾病,全球超过三亿人罹患哮喘。根据发病机制及临床表现,哮喘可分为诸多亚型,其中约80%的哮喘属于过敏性哮喘,主要由2型辅助性T细胞（Th2）和2型固有淋巴样细胞（ILC2）介导,引起气道高反应性、嗜酸粒细胞浸润、黏液过度分泌、气道重塑和支气管狭窄。大部分儿童以及约50%的成年人所患哮喘属于过敏性哮喘,其对过敏原的致敏常起始于生命早期,此时的免疫系统与成年人有很大不同。婴幼儿期的适应性免疫应答具有Th2应答倾向,但其具体机制尚待阐明。浆细胞样DC（pDC）作为一种特殊DC亚群,是机体重要的I型干扰素（IFN）分泌细胞,在抗病毒免疫中发挥重要作用。研究显示pDC对过敏性炎症反应具有负调控作用。我们发现相较于成年鼠,新生鼠肺脏pDC缺如。为阐明pDC的年龄差异对新生期2型免疫应答倾向的影响,本研究拟建立新生鼠及成年鼠过敏性哮喘模型,比较两个年龄组之间呼吸道过敏性炎症反应的差异,探讨pDC在其中的作用及机制;最后,采集儿童与成年哮喘患者诱导痰标本,比较不同年龄组之间pDC水平的差异,为验证pDC在过敏性哮喘中的作用提供临床依据。【方法】1)过敏性哮喘模型的建立和相应指标的检测建立鸡卵清白蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘模型:C57BL/6新生鼠（7天龄）和成年鼠（6-8周龄）,分别设置实验组（OVA）以及生理盐水对照组（saline）。哮喘模型建立分为致敏期和激发期两个阶段。致敏期于第0天和第7天经腹腔注射OVA-氢氧化铝佐剂,对照组小鼠同期给予相同量的生理盐水;激发期于第15到第19天连续5天雾化吸入OVA进行激发。最后一次激发后24小时,将小鼠处死并进行相应指标的检测。过敏性炎症反应指标包括:流式细胞术检测肺泡灌洗液及肺组织中嗜酸粒细胞、中性粒细胞、ILC2以及DC的数目,肺组织切片PAS染色检测支气管杯状细胞的化生与黏液的增生,支气管旁淋巴结（PBLN）细胞经体外OVA刺激后ELISA检测培养上清中细胞因子的水平以及ELISA检测血清中IgE、IgG1的水平等。2)新生鼠哮喘模型补充pDC后检测过敏性炎症反应为验证pDC对新生鼠过敏性炎症反应的影响,上述新生鼠模型于致敏期给予FMS相关酪氨酸激酶3配体（Flt3L）诱导其体内pDC的分化或致敏前过继转移成年鼠pDC,对照组小鼠同期给予相同量PBS。各组小鼠经OVA致敏和激发后检测过敏性炎症反应指标。3)成年鼠哮喘模型去除肺脏pDC后检测过敏性炎症反应为验证pDC对成年鼠过敏性炎症反应的影响,上述成年鼠模型于致敏期和激发期给予鼠120G8单克隆抗体去除肺脏pDC,对照组小鼠给予同型对照抗体IgG1。各组小鼠经OVA致敏和激发后检测过敏性炎症反应指标。4)新生鼠哮喘模型给予外源性IFN-α并检测过敏性炎症反应为探究IFN-α是否对新生鼠过敏性炎症反应发挥负调控作用,上述新生鼠模型于致敏期和激发期给予重组鼠IFN-α,对照组小鼠给予PBS。各组小鼠经OVA致敏和激发后检测过敏性炎症反应指标。5)野生型及IFNAR1^-/-新生鼠哮喘模型过继转移pDC后检测过敏性炎症反应为探究pDC是否通过分泌IFN-α发挥其对过敏性炎症反应的负调节作用,利用野生型和IFNAR1^-/-新生鼠建立上述哮喘模型,并于致敏前过继转移成年鼠pDC,对照组小鼠同期注射PBS。各组小鼠经OVA致敏和激发后检测过敏性炎症反应指标。6)pDC发挥负调控作用的机制研究ELISA检测上述新生鼠和成年鼠哮喘模型肺组织中IL-33、CCL20及GM-CSF的水平,以及上述新生鼠模型经pDCs过继转移后肺泡灌洗液中IL-33、CCL20及GM-CSF的水平;利用流式分选技术分选新生鼠呼吸道上皮细胞,体外经OVA刺激,ELISA检测培养上清中IL-33、CCL20及GM-CSF的水平;为验证pDC对呼吸道上皮细胞功能的影响,于OVA刺激同时加入外源性IFN-α或pDC培养上清,为确立pDC的作用机制,在该培养体系中加入IFNAR1的封闭抗体anti-IFNAR1。7)过敏性哮喘儿童及成年患者诱导痰样本的检测采集过敏性哮喘儿童与成年患者的诱导痰标本,流式细胞术和ELISA分别检测其中pDC的比例及IFN-α的水平,比较两年龄组之间的差异。【结果】1)成功建立过敏性哮喘模型经OVA致敏和激发后,新生鼠和成年鼠均出现过敏性炎症反应,表现为:肺组织中嗜酸粒细胞、DC及ILC2等数目增多,支气管杯状细胞化生及黏液分泌,PBLN培养上清中Th2型细胞因子水平增高以及血清中IgE和IgG1水平增高。相较于成年鼠,新生鼠经OVA致敏和激发后出现更为强烈的过敏性炎症反应。2)新生鼠肺脏pDC数目低于成年鼠OVA致敏和激发后成年组肺脏pDC的数目明显高于对照组,新生组无明显变化。新生鼠肺脏pDC的数目在对照组和实验组中均明显低于成年鼠。稳态下,新生鼠肺脏中pDCs的数目极少,且随着年龄的增加而不断升高。3)补充pDC可抑制新生鼠的过敏性炎症反应腹腔注射Flt3L或过继转移pDC均明显增加新生鼠肺脏pDC的数目。相较于对照组,Flt3L处理与pDC过继转移均显著降低OVA诱导的新生鼠过敏性炎症反应。4)去除pDC可增强成年鼠的过敏性炎症反应成年鼠哮喘模型中,120G8处理可显著降低其肺脏pDC的数目并增强OVA诱导的过敏性炎症反应。5)IFN-α处理可显著降低新生鼠的过敏性炎症反应新生鼠哮喘模型中,给予外源性IFN-α可显著降低OVA诱导的过敏性炎症反应。6)pDC依赖IFNAR1发挥其对过敏性炎症反应的负调控作用在新生鼠哮喘模型中,过继转移pDC于野生型小鼠可显著降低OVA诱导的过敏性炎症反应;但将pDC过继转移于IFNAR1^-/-小鼠后,其过敏性炎性反应与对照组无明显差别,均出现典型过敏性炎症反应。7)pDC通过抑制上皮细胞分泌细胞因子发挥其负调控作用在新生鼠和成年鼠哮喘模型中,OVA致敏和激发组小鼠肺组织中IL-33、CCL20以及GM-CSF的浓度显著高于对照组。在新生鼠哮喘模型中,pDCs过继转移显著降低OVA诱导的IL-33、CCL20及GM-CSF的分泌。流式分选的呼吸道上皮细胞经OVA刺激后,培养上清中IL-33与CCL20的浓度明显高于对照组。加入IFN-α或pDCs培养上清可显著抑制OVA诱导的IL-33与CCL20的分泌,加入IFNAR1封闭抗体则使该抑制作用消失。8)哮喘患儿诱导痰中pDCs与IFN-α的水平均低于成年患者哮喘患儿诱导痰中pDCs与IFN-α的水平均明显低于成年患者。【结论】我们的研究表明,pDCs以IFN-α/IFNAR依赖的方式发挥其对过敏性气道炎症和2型免疫应答的负调控作用。相比于成年鼠,新生鼠因缺乏pDCs而失去对呼吸道上皮细胞的负调控作用,致使其接触过敏原后大量分泌IL-33、CCL20和GM-CSF,进而招募更多ILC2s和CD11b⁺cDCs至肺脏局部,最终出现更为剧烈的2型免疫应答。这种机制使得新生鼠在过敏原入侵后出现更为严重的过敏性呼吸道炎症反应。哮喘儿童中pDCs和IFN-α的情况与新生鼠类似,均处于非常低的水平,这可能是其易发过敏性哮喘的原因之一。上述结果提示,新生期缺乏pDCs对呼吸道上皮细胞的负调控,是过敏性哮喘的易感因素之一。本研究的发现可为临床过敏性哮喘的治疗提供新的思路。