类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎症及对称性、破坏性关节病变为主要特征的慢性自身免疫性疾病。目前RA的发病病因尚未明确,其主要特征之一的滑膜炎症可反复发作,引起关节软骨及骨质破坏,最终导致关节畸形及功能障碍。血管翳的形成是滑膜炎症发生的病理基础,滑膜血管新生(angiogenesis)是血管翳形成和维持的关键,在RA病情进展中扮演着重要角色,且其出现较早,甚至在炎症特异的临床和组织学征象出现前就已经发生。新生血管为高度增生的滑膜组织提供氧和营养物质,同时使更多的细胞因子、炎性因子浸润滑膜,促使滑膜组织类肿瘤样增殖,从而维持并促使滑膜血管翳形成。血管新生与滑膜炎症相互交织、协同作用,两者有着密不可分的联系。因此,抑制滑膜血管新生可能是治疗RA的一种可行、有效的临床方案。血管新生是一个复杂的过程,受到众多的细胞因子和炎性因子调控,其中最强有力的促血管生成因子——血管内皮生长因子(VEGF),直接参与血管形成。在炎症病理条件下,VEGF分泌增多,刺激其受体之一的血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)分泌增加,两者结合之后,激活细胞内信号分子AKT、mTOR、ERK1/2和p38等,从而促进内皮细胞分化、增殖、迁移和侵袭。因此,研究VEGFR2以及相关的细胞内信号分子与血管新生之间的作用,可能对阐明类风湿关节炎的发病机理提供一定的科学依据。过山枫(Celastrus aculeatus Merr.)属于卫矛科(Celastraceae)南蛇藤属植物,中国民间常用于治疗风湿骨病。我们先前的研究发现,过山枫乙醇提取物对大鼠AA模型关节炎症具有显著抑制作用,同时对大鼠关节滑膜及软骨损伤具有保护作用。扁蒴藤素是过山枫三萜部位中主要活性成分之一,一种天然的木栓烷型五环三萜类化合物。研究报道扁蒴藤素具有抗菌、抗氧化应激和抗癌等活性。为此,在原有研究的基础上,我们探讨扁蒴藤素抑制RA滑膜血管新生作用并进一步阐明其可能的分子机制。目的:1考察扁蒴藤素抗血管新生的药效作用。2探讨扁蒴藤素对佐剂关节炎大鼠滑膜血管新生的影响。3研究扁蒴藤素抗血管新生作用的作用机制。方法:1扁蒴藤素对HUVECs和HFLS-RA增殖、迁移、侵袭和管腔形成的影响MTT法检测扁蒴藤素对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(HFLS-RA)在正常培养条件下的细胞存活率以及VEGF诱导下HUVECs增殖的情况。采用划痕的方法评价在VEGF诱导下HUVECs和HFLS-RA的细胞迁移能力。Transwell小室方法观察扁蒴藤素对VEGF诱导人HFLS-RA趋药性迁移的影响。预先铺有基质胶的Transwell小室考察在VEGF诱导下HUVECs的侵袭能力。以人工基质胶模型评价扁蒴藤素对HUVECs形成管腔能力的影响。2扁蒴藤素对大鼠动脉环血管生成的影响离体培养大鼠动脉环,给予扁蒴藤素处理,培养9天,换PBS作背景,用显微摄像系统拍照和记录微血管生长情况。实验每次设平行孔3 孔,重复三次。3扁蒴藤素对斑马鱼节间血管发育的影响采用TgFli1-GFP(+/+)转基因斑马鱼作为实验研究对象,斑马鱼胚胎发育至6 hpf,将不同浓度的扁蒴藤素加入斑马鱼胚胎培育体系与胚胎共同孵育;待胚胎发育至30 hpf,破卵,置于荧光显微镜下,观察并计数斑马鱼胚胎节间血管数目、血管芽数,测定血管长度并计算抑制率,并拍照作记录。4扁蒴藤素对AA大鼠滑膜血管新生作用的研究佐剂性关节炎(AA)大鼠模型制备:除空白组的大鼠外,其余的大鼠在大鼠尾根部经皮下注射Mtb诱导剂制备AA大鼠模型。观察AA大鼠的关节红肿、畸形表现,并拍照做记录。采用临床炎症评分和测定大鼠足体积的变化,评价AA大鼠关节炎症。组织病理切片、HE染色观察大鼠关节病理的情况。采用免疫组化方法检测大鼠滑膜血管标志物CD34的表达,并进行血管密度计数。ELISA检测大鼠血清中促血管生成因子Ang-1和MMP-9以及western blot检测大鼠滑膜中VEGF、VEGFR2和p-VEGFR2的表达水平。5体外培养HUVECs中VEGF诱导的血管新生相关蛋白的检测western blot检测VEGF诱导的HUVECs中VEGFR2以及其下游中的PI3K-AKT-mTOR,ERK1/2,JNK和p38信号通路相关蛋白的表达水平。结果:1扁蒴藤素对HFLS-RA和HUVECs的细胞活性及VEGF诱导HUVECs增殖的影响扁蒴藤素抑制HFLS-RA和HUVECs的存活率具有浓度和时间依赖性关系。VEGF具有刺激HUVECs的增殖作用,扁蒴藤素(0.125、0.25、0.50 μM)对VEGF诱导的HUVECs增殖率显著低于VEGF对照组。提示,扁蒴藤素抑制VEGF诱导的HUVECs增殖。2扁蒴藤素抑制VEGF诱导HFLS-RA迁移的能力划痕实验结果表明,与VEGF组比较,给药组HFLS-RA迁移数目明显减少。Transwell小室细胞联合培养诱导HFLS-RA趋药性迁移模型,空白对照组HFLS-RA有少量的细胞发生自主迁移;在VEGF诱导下,细胞迁出小室的数目明显增多。扁蒴藤素处理后,与VEGF组比较,细胞迁移的数目明显减少。3扁蒴藤素对VEGF诱导HUVECs迁移、侵袭和管腔形成的影响划痕实验结果显示,VEGF组HUVECs明显从划痕边缘向划痕内部迁移,细胞迁移数目明显增多,差异均具有统计学意义;扁蒴藤素处理后,细胞迁移能力显著下降。细胞在Transwell小室培养24 h后,显微镜下观察可见各组均有数量不等的HUVECs细胞侵入膜下室,药物组侵出小室细胞的平均数与VEGF组相比均显著减少,表明扁蒴藤具有降低HUVECs侵袭能力的作用。人工模拟基质胶模型的实验结果显示,VEGF组HUVECs形成的管腔样结构多且宽度大;与VEGF组比较,扁蒴藤素能使HUVECs管腔样分支点数明显减少,结果表明扁蒴藤素可以抑制HUVECs的管腔形成。4扁蒴藤素抑制VEGF诱导的大鼠动脉环血管新生大鼠动脉环培养第9天,可观察到VEGF组的动脉环周围有大量内皮细胞从动脉段切口出向外增殖、迁出,从动脉壁长出的血管芽排列紧凑,分支的微血管的管腔样结构密集。扁蒴藤素低、中、高剂量组动脉环周围内皮细胞增殖减少;与VEGF组比较,毛细血管样结构生成显著减少,并呈剂量依赖关系。5扁蒴藤素影响斑马鱼胚胎节间血管发育扁蒴藤素能够明显抑制斑马鱼胚胎血管的发育,高浓度时,胚胎节间血管和背侧纵向血管缺失、断裂、发育不全,只长出血管芽或者血管长度极短;部分血管排列不齐、紊乱,血管走向失去规律性。扁蒴藤素给药组与空白对照组的ISV数量比较,呈现一定的量效关系,随药物浓度的升高,ISV数量减少。血管发育受到抑制,停留在萌芽阶段或者长度极短,药物组较空白对照组血管芽数明显增多;与空白对照组比较,药物组血管长度抑制率明显升高,部分血管未长至正常血管一半,明显细小,没有与背侧纵向血管相连。6扁蒴藤素减轻AA大鼠关节炎症(AI值)及足趾肿胀度模型组大鼠随着炎症的发展进程,关节炎症和足趾肿胀逐渐增加,第21天达到峰值。药物干预后,从免疫后第15天开始,各个给药组大鼠的临床评分AI值和足趾容积出现逐渐降低的趋势,大鼠关节及足趾的红肿程度明显减轻。7扁蒴藤素减轻AA大鼠滑膜组织的炎症程度大鼠关节病理结果显示,AA模型大鼠滑膜细胞数目明显增加,提示滑膜组织增厚,增生的滑膜形成血管翳,滑膜组织衬里层有大量的炎性细胞浸润、渗出,伴有不同程度的软组织水肿,关节软骨面损伤。扁蒴藤素治疗后大鼠关节炎症细胞减少,关节间隙保持完整,滑膜组织轻度增生,未见关节软骨损伤。8扁蒴藤素抑制AA大鼠关节滑膜血管新生大鼠膝关节组织免疫组化染色、CD34标记血管;结果显示,正常大鼠膝关节滑膜中CD34基本没有表达,模型组大鼠滑膜中出现较强的阳性表达,显现棕黄色,滑膜组织血管丰富,血管大量增生且密集,新生的血管以毛细血管为主。药物治疗组血管生成明显减少,与模型组比较,滑膜血管密度显著低于模型组。9扁蒴藤素对AA大鼠Ang-1、MMP-9、VEGF和VEGFR2的影响大鼠血清检测结果表明,AA模型组大鼠血清中Ang-1和MMP-9表达水平较空白对照组均升高;与模型组比较,甲氨蝶呤组和扁蒴藤素低、高剂量组大鼠血清中Ang-1和MMP-9含量均显著降低。与正常大鼠比较,AA大鼠滑膜中VEGF和p-VEGFR2蛋白表达的水平均有明显的上调。甲氨蝶呤和扁蒴藤素低高剂量治疗后,相对于AA大鼠,能够下调VEGF和p-VEGFR2蛋白的表达。10扁蒴藤素抑制VEGF诱导HUVECs中VEGFR2的磷酸化在非毒剂量的范围内,扁蒴藤素能够显著抑制VEGF诱导HUVECs中VEGFR2的磷酸化,并呈剂量依赖关系;然而,对总的VEGFR2蛋白的表达水平无明显的影响,提示扁蒴藤素抑制VEGF诱导血管新生的活性是通过抑制VEGFR2的磷酸化而实现。11扁蒴藤素抑制VEGF诱导HUVECs中VEGFR2下游的PI3K-AKT-mTOR,ERK1/2,JNK和p38信号通路活化对VEGFR2下游与血管新生相关的蛋白水平检测,结果表明,50ng/mL的VEGF 能够显著诱导 HUVECs 中 PI3K、AKT 和 mTOR 以及 ERK1/2、JNK 和 p38的磷酸化,扁蒴藤素对下游相关信号分子的活化具有较好的抑制作用。结论:1扁蒴藤素具有抑制VEGF诱导HFLS-RA的迁移以及VEGF诱导HUVECs的增殖、迁移、侵袭和管腔形成的作用。2扁蒴藤素能够抑制大鼠动脉环血管生成和斑马鱼节间血管发育。3扁蒴藤素抑制滑膜血管新生的作用可能是其减轻AA大鼠关节炎症、治疗RA的重要途经之一。4扁蒴藤素对血管新生的抑制作用是通过抑制VEGF诱导HUVECs的VEGFR2以及下游PI3K-AKT-mTOR,ERK1/2,JNK和p38信号通路相关蛋白的磷酸化水平而实现的。