非霍奇金淋巴瘤(non—Hodgkins lymphoma,NHL)是起源于淋巴细胞不同分化阶段的一组异质性(heterogeneity)恶性肿瘤。在过去的30年里,非霍奇金淋巴瘤在世界范围内的发病率几乎增长了一倍,使之成为继肺癌和黑素瘤之后第3个增长最快的癌症。在美国,2008年新诊断NHL病例估计有66120例,已成为第5位的常见恶性肿瘤。NHL大多为B细胞性,在美国,B细胞HLN的比例约80～85％,我的T细胞NHL的比例较西方为高,约为30％。　　 化疗是非霍奇金淋巴瘤主要的传统治疗方法,由于受细胞毒药物副作用的限制,很难再进一步提高化疗药物的剂量,另一方面,有研究也表明,传统细胞毒化疗药物进一步提高非霍奇金淋巴瘤临床疗效的空间也十分有限了。靶向免疫治疗提高了NHL的治疗效果。研究表明美罗华联合CHOP方案治疗老年弥漫大B细胞淋巴瘤,治疗组和对照相比,5年的DFS提高21％(66％vs45％),5年的总生存提高13％(58％vs43％)。　　 重组人CD22单克隆抗体(代码:SM03)是由深圳龙瑞药业有限公司开发。SM03是一个人-鼠嵌合化IgG1单克隆抗体,由鼠源抗体重链和轻链可变区(VariableRegions)、和人源抗体kappa轻链和gamma-1重链恒定区(Kappa/IgG1 ConstantRegions)构成。重组人CD22单克隆抗体分子量为148 kD,能特异的识别并结合正常的和恶性B淋巴细胞表膜抗原CD22。SM03和恶性B淋巴细胞表膜抗原CD22结合后,进而通过诱导肿瘤细胞凋亡(apoptosis)、抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)等免疫效应机制,杀伤肿瘤细胞。　　 CD22是一个分子量135-kd的唾液酸糖蛋白,并严格局限表达在分化成熟的B-细胞表面。一旦表达为膜蛋白,CD22持续存在、直至分化成熟为浆细胞,在B-细胞的分化、发育、成熟过程中起关键作用。CD22在淋巴滤泡斗笠区(mantle)和B细胞生发中心边缘区表达程度高。CD22在B细胞非霍奇金淋巴瘤广泛表达,其确切功能目前尚不清楚。研究表明其对于B细胞的存活有重要作用。B细胞CD22无表达的鼠,其B细胞凋亡加速,寿命缩短。由于CD22表达严格地局限于成熟和癌变的B细胞表面,与CD20分布相似,因此使得CD22成为继CD20后可用于新药开发而令人注目的抗原靶点。　　 Epratuzumab(依帕珠单抗)是一个特异性抗B淋巴细胞CD22抗原特异性表位的人源化单克隆抗体。Epratuzumab治疗非霍奇金淋巴瘤的Ⅰ—Ⅱ期临床研究已经完成,已经进入Ⅲ期临床研究阶段。已完成的Ⅰ/Ⅱ期临床试验显示,Epratuzumab起始剂量从120mg/m2到1000mg/m2,每周一次,连用4周给药,患者耐受良好,少数在输注后出现1或2级不良反应,主要是首次输液时畏寒、寒颤、恶心和低血压。Epratuzumab在人体血清半衰期较长,为23.9天。在240 mg/m2和360 mg/m2剂量级可以获得明显的临床抗肿瘤疗效。对于滤泡型或复发进展型非霍奇金淋巴瘤,Epratuzumab治疗后均可获得一定疗效,甚至对美罗华治疗失败的患者,Epratuzumab治疗后也可获得疗效,对于滤泡型淋巴瘤效果较好。　　 SM03由深圳龙瑞药业有限公司开发,是人一鼠嵌合化IgG1单克隆抗体。抗NHL的鼠源SM03抗体与Epratuzumab一样,也是特异于CD22抗原的B表位,鼠源SM03经过“嵌合化”或“人源化”改建后,应表现与Epratuzumab相似的安全性和临床疗效。　　 SM03临床前研究表明,SM03能特异的识别并结合正常的和恶性B淋巴细胞表膜抗原CD22,SM03抗体高度靶向性地与B细胞组织器官——脾、淋巴结和恶性淋巴瘤细胞特异结合,而与其他正常人体组织器官没有交叉反应。SM03抗体可以诱导猕猴和食蟹猴外周血CD22+B细胞清除效应。临床前药代动力学研究显示体内药动学符合二房室模型。　　 本研究分为四部分:第1部分选择B细胞淋巴瘤细胞株Raji和Ramos细胞株,研究SM03体外对于Raji和Ramos细胞株抑瘤作用,探讨PI3K信号传导凋亡通路在SM03抗B细胞淋巴瘤中的作用；第2部分采用免疫组化方法检测非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织CD22抗原的表达情况,初步探讨CD22抗原在非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织的表达和临床病理特征的关系,筛选SM03靶向治疗的患者；第3部分研究重组人CD22单克隆抗体SM03在中国CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者的剂量安全性和耐受性,为确定后续Ⅱ/Ⅲ期临床试验用药剂量和频次奠定基础,并初步研究中国CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者对SM03的初步的抗肿瘤疗效反应；第4部分采用竞争ELISA法研究SM03在中国CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者的的药代动力学行为,并计算药代动力学参数,考察重组SM03药代动力学参数和中国CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者对SM03的疗效反应和毒性的关系,为Ⅱ期临床试验设计合理给药方案和临床安全有效用药提供理论依据。　　 第1部分重组人CD22单抗隆抗体SM03对人B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞株的体外抑瘤作用以及抑瘤机制的实验研究目的:研究重组人CD22单克隆抗体(SM03)对B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞株的体外生长抑制作用,探讨PI3K信号传导凋亡通路在SM03抗人B细胞淋巴瘤中的作用。　　 方法:选择B细胞淋巴瘤细胞株Raji和Ramos细胞株,流式细胞仪检测Raji和Ramos细胞的CD22抗原表达量,流式细胞仪检测细胞的凋亡率和周期分布；采用CCK-8法测定SM03对Ramos和Raji细胞生长抑制作用；并采用Western blot法检测Raji和Ramos细胞株Bcl-2、Bax、Bcl-xL、Mcl-1、Akt及p-Akt蛋白的表达情况。　　 结果:SM03对Raji和Ramos细胞株的体外抑瘤作用均较弱。SM03在0—400μg/ml浓度范围内对Raji细胞的抑制率为26.18～31.84％,平均值为30.64±3.26％,SM03在0—400μg/ml浓度范围内对Ramos细胞的抑制率为2.67～22.47％,平均值为11.93±9.96％。　　 SM03在25、50、100μg/ml的剂量下并不引起Ramos细胞的凋亡,亚G1期细胞所占的比例分别为1.6％、2.0％、1.8％和2.2％；SM03在25、50、100μg/ml的剂量能引起Raji细胞的凋亡,亚G1期细胞所占的比例分别为4.6％、6.9％、13.7％和17.6％；相同条件下均未能对两种细胞的周期分布产生影响。　　 在Ramos细胞中未检测到Bcl-2蛋白的表达；p—Akt蛋白在两株细胞中均未检测到表达；SM03未能对Bcl-2家族蛋白(Bax、Bcl-2、Bcl-xL及Mcl-1蛋白)在Ramos和Raji细胞的表达产生影响；Akt蛋白在Raji细胞中观察到随SM03剂量的增加其表达量逐渐减少；Akt蛋白在Ramos细胞中未检测明显的变化。　　 结论:SM03体外对B细胞淋巴瘤细胞株的抑瘤作用较弱。在25、50、100μg/ml的剂量能引起Raji细胞的凋亡,并能抑制Akt蛋白的表达,但对p-Akt并不产生影响,对Bcl-2家族蛋白表达不产生影响。SM03不通过PI3K/Akt信号通路和Bcl-2家族蛋白凋亡途径诱导Raji细胞的凋亡。　　 第2部分 B细胞非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织CD22抗原表达检测及临床意义目的:检测CD22抗原在非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织中的表达,初步探讨CD22抗原在非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织的表达和临床病理特征的关系,筛选SM03靶向治疗的患者。　　 方法:采用免疫组化方法检测B细胞非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织CD22抗原的表达,初步探讨肿瘤组织CD22抗原表达和临床病理特征等的关系。　　 结果:CD22抗原可以采用免疫组化方法在B细胞非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织中检测出,阳性表达的棕黄色或棕褐色颗粒主要见于细胞浆和细胞膜。全组21例,阴性0例,弱阳性(+)11例,中等阳性(++)7例,强阳性(+++)3例,高表达10例,低表达11例,阳性率100.00％(21/21),中等阳性率33.33％(7/21),强阳性率14.29％(3/21)。　　 全组8例弥漫大B细胞淋巴瘤患者,肿瘤组织中CD22抗原呈弱阳性表达2例,中等阳性表达4例,强阳性表达2例；8例滤泡性淋巴瘤患者,弱阳性表达7例,中等阳性表达1例；2例滤泡转弥漫的非霍奇金淋巴瘤患者,1例为中等阳性的表达,1例为强阳性表达,2例慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤患者,肿瘤组织CD22表达均为弱阳性。1例伯基特淋巴瘤患者,肿瘤组织CD22抗原呈中等阳性表达。　　 全组21例患者,20例可评价疗效。4例临床疗效评价进展的患者,肿瘤组织中CD22高表达3例,低表达1例。1例观察期结束后续随访临床疗效获得PR的患者,肿瘤组织中CD22抗原为弱阳性表达。　　 结论:CD22抗原在B细胞非霍奇金淋巴瘤中广泛表达,可以采用免疫组化的方法检测出,检测方法简单、易行,可用于临床作为B细胞非霍奇金淋巴瘤免疫标记检测,CD22表达和临床病理特征的关系需进一步研究。　　 第3部分重组人CD22单克隆抗体SM03治疗CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤Ⅰ期临床试验的耐受性研究目的:研究重组人CD22单克隆抗体SM03在中国CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者的剂量安全性和耐受性,为确定后续Ⅱ/Ⅲ期临床试验用药剂量和频次奠定基础;初步考察SM03对中国B细胞非霍奇金淋巴瘤患者的初步疗效反应以及免疫学影响。　　 方法:SM03从低剂量60mg/m2开始,按照60mg/m2,120 mg/m2,240 mg/m2,360 mg/m2,480 mg/m2剂量级,剂量循序渐进,逐步爬升,每个剂量级入组1～6例患者,采用多剂量给药,SM03加入250ml生理盐水中,恒速滴注3小时,每周给药1次,连续4周给药,考察SM03的临床安全性和耐受性。SM03治疗第28天,采用CT或MR检查评价SM03治疗效果。　　 结果:从2007年4月至2008年11月,21例在中山大学肿瘤防治中心治疗的CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者入组。21例患者中,男10例,女11例,年龄范围24～67岁,中位年龄52岁,体力情况0～2级。全组21例患者,共进行87次SM03给药,其中360mg/m2剂量组1例患者进行2个疗程共8次SM03给药,240mg/m2剂量组1例患者因发生SAE只进行3次SM03治疗。入组21例患者,均出现不同程度的不良事件。药物相关的不良反应轻微,多为1～2级。常见不良事件包括:发热、疲劳、胃纳下降、皮疹、失眠症、注射局部皮肤改变、肿瘤部位疼痛、肝肾功能损害、白细胞降低、血红蛋白下降、淋巴细胞减少、蛋白尿、尿潜血、尿白细胞增多、部分凝血活酶时间延长和心肌劳损等。其中60mg/m2剂量组1例完成4次给药后,观察期发生咽喉部大出血(与试验药物可能无关,己按照严重不良事件报告),240mg/m2剂量组1例3次给药后,发生上消化道大出血(与试验药物可能无关,已按照严重不良事件报告),给予退组,120mg/m2剂量组1例4次给药后肿瘤明显进展,肿瘤致疼痛非常明显,给予退出观察,进行化疗处理。360mg/m2剂量组出现1例剂量限制性毒性,表现为4级中性粒细胞减少,480mg/m2剂量级患者,50％(3/6)出现局部注药部位皮肤改变。没有出现MTD。21例入组患者中,按照1998年国际工作组淋巴瘤疗效评价标准,20例可评价疗效,4患者肿瘤进展,16例SD。进展的4例患者,病理类型均为弥漫大B,疗效SD的患者,多数病例,目标病灶双径乘积之和(SPD)治疗后稍有减小,病理类型为滤泡型淋巴瘤的患者,疗效稍好,1例滤泡型淋巴瘤在SM03试验方案完成后的随访中,肿瘤明显减小,疗效达PR。360mg/m2和480mg/m2剂量组SM03治疗后SPD缩小患者的比例较高。　　 结论:SM03耐受性研究表明,SM03在中国CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者,安全性和耐受性良好；初步显示了SM03对中国CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者有一定的抗肿瘤活性,有一定的清除B淋巴细胞的作用,对细胞和体液免疫没有明显影响；推荐360mg/m2和480mg/m2作为进一步研究研究剂量。　　 第4部分重组人CD22单克隆抗体SM03治疗CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤Ⅰ期临床试验的药代动力学研究目的:考察重组人CD22单克隆抗体SM03在中国CD22阳性的B细胞非霍奇金淋巴瘤患者体内的药代动力学行为。为Ⅱ期临床试验设计合理给药方案和临床安全有效用药提供理论依据。　　 方法:20例中国CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者,爬坡依次进入60mg/m2,120 mg/m2,240 mg/m2,360 mg/m2,480 mg/m25个SM03剂量级,采用竞争性ELISA法检测的SM03血浆药物浓度,并计算SM03药代动力学参数,描述SM03在中国CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤的药代动力学行为。　　 结果:从2007年4月至2008年11月,20例在中山大学肿瘤防治中心治疗的CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者入组。20例患者中,女性患者10例,男性患者10例,年龄范围24～62岁,中位年龄52岁,均值±标准差:52±9.80岁,身高范围:146.5～174.5cm,均值±标准差:160.75±8.60cm；体重范围:37.5～77 kg,均值±标准差:56.95±11.06 kg；体表面积:1.25～1.89 m2,均值±标准差:1.60±0.18 m2；体重指数:16.88～27.06 kg/m2,均值±标准差:21.88±3.11kg/m2。ELISA法满足SM03药代动力学研究的要求。SM03溶液的标准曲线四参数方程为y=POWER(x,1/-1.1134)*24.8812,两者的斜率、截距具有很好的相关性；批内变异系数CV:5.5～9.6％,批间变异系数CV:8.1～11.1％,均小于15％,方法的精密度符合药代动力学方法学要求；样本稀释后测定方法稳定,重现性好,准确度为111.2±0.68％,变异系数CV:为3.57％;本试验中样品解冻三次后保持稳定性。　　 对剂各量级患者在各个检测点(0、1、2、3、3.5、5、11、27、51、75、123、147h)血清中SM03浓度,血清SM03浓度-时间曲线表现为双指数曲线,滴注后血清SM03浓度开始迅速升高,给药结束后(3小时)左右,血浆SM03达最高浓度,后开始缓慢下降,下降到接近前一次给药的低点附近,每次给药的基线抬高不太明显。　　 20例各个剂量级中国CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者,SM03的主要药物代谢动力学参数(Cmax、K、T1/2、Vd、CL、MRT、AUC0-∞、AUC0—t、Vss等)总结分别见下表。　　 结论:采用竞争ELISA法研究SM03在B细胞非霍奇金淋巴瘤患者的的药代动力学行为,所建立的方法学符合药代动力学测定的规定要求。　　 重组人CD22单克隆抗体SM03滴注入中国CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者体内后,血清中游离SM03浓度-时间曲线表现为双指数曲线,滴注结束浓度最高,随着剂量增加Cmax增加,个体间变异较大。　　 SM03不同剂量级,血清中游离抗体SM03在中国CD22阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者中的药代动力学参数分别为:　　 60 mg/m2:Cmax:36.12μg/mL,t1/2:63 h,AUC0-t:2075.163μg/L·h,AUC0-oo:2556.288μg/L·h,MRT0-∞:70.89 h,CL:0.023472 L/h·m2,Vd:2.133776L/m2,Vss:1.6640453 L120 mg/m2:Cmx:(40.77±9.57)μg/mL,t1/2:(196.48±60.1)h,AUC0-t:(112139.9+108390.2)μg/L·h,AUC0-oo:(399554+317301.5)μg/L·h,MRT0-∞:(111.02±7.34)h,CL:(0.018138±0.003136)L/h·m2,Vd:(5.006544±0.683462)L/m2,Vss:(2.002148±0.214966)L240 mg/m2:Cmax:(126.81±23.34)μg/mL,t1/2:(143.36±23.46)h,AUC0-t:(632438.5±218351.9)μg/L·h,AUC0-∞:(2139238±956755.1)μg/L·h,MRT0-∞:(103.55+6.57)h,CL:(0.013341±0.004942)L/h·m2,Vd:(2.676217±0.846733)L/m2,Vss:(1.361334±0.453195)L360 mg/m2:Cmax:(196.03±30.98)μg/mL,t1/2:(194.83±110.48)h,AUC0-t:(1066470±137764.7)μg/L·h,AUC0-∞:(4670989±2652243)μg/L·h,MRT0-∞:(109.29±11.22)h,CL:(0.009825±0.003185)L/h·m2,Vd:(2.38036±0.379625)L/m2,Vss:(1.045803±0.260127)L480 mg/m2:Cmax:(525.81±102.39)μg/mL,t1/2:(324.01+274.41)h,AUC0-t:(3791400±798343)μg/L·h,AUC0-∞:(23185478±25102489)μg/L·h,MRT0-∞:(116.08±18.29)h,CL:(0.005094±0.003653)L/h·m2,Vd:(1.325607±0.268666)L/m2,Vss:(0.539424±0.336782)L随着SM03剂量的增加,血清中SM03的AUC呈线性增加,在60mg/m2～360mg/m2剂量范围,AUC(0-t)随剂量呈线性增加；但在480mg/m2剂量组AUC(0-t)明显高于360mg/m2,呈现非线性药代特征。个体间均存在差异。　　 在60mg/m2～480mg/m2剂量范围,未观察到SM03血药浓度和患者剂量限制性毒性反应的明显相关性。推荐360mg/m2为进一步研究剂量。