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第一部分:口服乙酰半胱氨酸对博莱霉素大鼠肺损伤的作用研究目的:研究口服乙酰半胱氨酸(NAC)对博莱霉素诱导的大鼠肺损伤的干预作用。方法:240只SD大鼠,随机分为6组:正常对照组,博莱霉素处理未治疗模型组,NAC小剂量治疗组( NAC 100 Mg/kg.d),NAC大剂量治疗组( NAC 500 Mg/kg.d),强的松组及NAC联合强的松治疗组。采用博莱霉素气管内注射建立模型,分别于造模后3、7、14及28天处死动物,标本进行病理形态学观察及Ashcroft评分,采用酶联免疫法检测肺泡灌洗液中碱性成纤维细胞生长因子及血小板源性生长因子的水平。结果:博莱霉素气管内注射后14天,各组大鼠肺组织病理组织学观察示:正常PBS组肺组织结构清晰,无炎性细胞浸润;博莱霉素处理未治疗组可见肺组织结构破坏,重度炎性细胞浸润以及纤维组织增生实变。NAC、强的松和联合治疗组肺组织损害减轻,炎性细胞浸润及纤维组织增生明显减少。与未治疗组相比,NAC大、小剂量组,强的松以及联合治疗组肺损伤评分均显著降低(P < 0.01)。28天后,强的松组及联合治疗组评分基本恢复正常,而模型组,NAC大、小剂量组纤维化评分仍高于正常对照(P < 0.05)。采用NAC大剂量,强的松及联合治疗后,肺组织羟脯氨酸含量显著较未治疗组降低(P < 0.01)。至28天时,各组肺组织羟脯氨酸含量与正常对照相比均无显著差异。未治疗组肺泡灌洗液中bFGF与PDGF-BB水平在博莱霉素处理后第三天达高峰, ( (212.69±55.11)和(663.96±195.47) pg/ml)显著高于正常对照组((41.60±20.49)和(54.92±24.33) pg/ml),P值分别为0.001和0.000,各治疗组较未治疗组上述两种因子的水平均明显下降。博莱霉素处理7天后未治疗组两种因子下降,至28天时基本与正常对照组相同。其他治疗组变化趋势基本相同。结论:NAC作为一种抗氧化剂,早期干预能够减轻博莱霉素所致大鼠的肺损伤;NAC的抗纤维化作用可能与其抗炎及调节肺组织局部生长因子PDGF等的浓度有关;NAC与强的松联合用药可能不产生抗纤维化的协同作用。第二部分乙酰半胱氨酸对非特异性间质性肺炎患者肺成纤维细胞的影响第一节NAC对正常与非特异性间质性肺炎患者肺成纤维细胞增殖的影响目的:比较NAC对正常与非特异性间质性肺炎(NSIP)患者肺成纤维细胞增殖的影响。方法:分离培养NSIP患者及正常肺成纤维细胞,观察正常肺成纤维细胞与NSIP患者肺成纤维细胞增殖及NAC的干预作用,比较NAC同一剂量梯度对肺泡上皮细胞A549基础增殖的影响。结果:①20 mM NAC对原代培养的人肺成纤维细胞增殖具有明显的抑制作用,而对肺泡上皮细胞系A549的增殖无明显影响。②5、10、20及40 mM NAC对正常及NSIP患者肺成纤维细胞增殖均具有抑制效应。在正常肺成纤维细胞,NAC的抑制作用呈明显的剂量依赖性,浓度达40 mM时细胞增殖基本中止。但在NSIP患者肺成纤维细胞,NAC对其增殖的抑制并不随浓度升高而增加,浓度在40 mM时,细胞仍持续增殖。③NAC能够抑制肺成纤维细胞前胶原mRNA的合成,以及转化生长因子-β1(TGFβ1)诱导的前胶原mRNA的合成。结论:1. NAC能够抑制肺成纤维细胞的增殖,在一定浓度范围内抑制作用具有细胞特异性。2. NSIP患者肺成纤维细胞对NAC的增殖抑制作用存在明显耐受性。3. NAC能够直接抑制肺成纤维细胞的胶原合成。第二节NSIP患者肺成纤维细胞对TGF-β1刺激表达α-SMA的反应性及NAC的干预作用目的:比较NAC对正常肺成纤维细胞和NSIP患者肺成纤维细胞α-SMA表达的影响以及TGF-β1刺激的反应性。方法:利用已经分离鉴定的正常及NSIP患者肺成纤维细胞,应用免疫印迹法分别观察NAC和TGF-β1刺激,以及NAC对TGF-β1刺激后的正常与NSIP患者肺成纤维细胞α-SMA及STAT3蛋白表达的影响。结果:①基态下,NSIP肺成纤维细胞表达α-SMA水平较正常肺成纤维细胞高(升高25.66%,P<0.05,与HFB相比),NAC处理可显著增加NSIP肺成纤维细胞α-SMA的表达(升高40.85%, P<0.05,与对照组相比),但对正常肺成纤维细胞无影响。TGF-β1处理轻度增加了正常肺成纤维细胞表达α-SMA,但对NSIP肺成纤维细胞却呈现显著下调作用(下降35.92%,P<0.05,与对照组相比)。此外,在NSIP肺成纤维细胞,如先用TGF-β1处理再添加NAC,则NAC诱导α-SMA表达的作用被阻断。②STAT3在正常肺成纤维细胞呈弱表达,TGF-β和NAC刺激没有明显影响。NSIP患者肺成纤维细胞基态下表达较高水平的STAT3(1.15±0.13,P<0.05,与HFB相比),NAC能够进一步增强其表达(1.89±0.28,P<0.01), TGF-β1可显著抑制其表达(0.58±0.09,P<0.05),TGF-β1刺激后再添加NAC,其原先对STAT3的诱导效应被阻断(1.19±0.10,P<0.01)。基态下NSIP肺成纤维细胞即可表达磷酸化STAT3,TGF-β1刺激15分钟后磷酸化STAT3完全被抑制;而TGF-β1可增加正常肺成纤维细胞磷酸化STAT3的表达。结论:1. NSIP患者肺成纤维细胞具有与正常肺成纤维细胞相比不同的生物学特性,基础状态下能够表达较高水平的α-SMA与非磷酸化STAT3,以及活化状态的磷酸化STAT3分子。2. NAC能够诱导NSIP患者肺成纤维细胞α-SMA的表达,与其诱导了NSIP细胞STAT3信号活化有关。3. TGF-β1能够下调NSIP肺成纤维细胞活化的STAT3信号,从而抑制了α-SMA的表达。第三节TGF-β1对NSIP患者肺成纤维细胞释放趋化因子及细胞因子的影响及NAC的作用目的:比较TGF-β1对正常肺成纤维细胞和NSIP患者肺成纤维细胞趋化因子及细胞因子释放的影响及NAC的干预作用。方法:利用已分离鉴定的正常及NSIP患者肺成纤维细胞,采纳液相芯片技术观察正常与NSIP患者肺成纤维细胞经TGF-β刺激后趋化因子和细胞因子的变化,以及添加NAC对TGF-β1介导的趋化因子和细胞因子释放的影响。结果:①在基础状态下,NSIP患者肺成纤维细胞较正常肺成纤维细胞产生较多的趋化因子及细胞因子如:MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIG、MCP-3、VCAM-1、TNF-α、TGF-β、ENA-78、MMP-9及IL-18。少数因子较正常肺成纤维细胞减少,如趋化因子IP-10,基质金属蛋白酶MMP-7以及黏附分子ICAM-1。②T GF-β1能够引起NSIP患者及正常肺成纤维细胞增加趋化因子及细胞因子生成释放,NSIP肺成纤维细胞经诱导产生如ICAM-1、IL-18、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MMP-7及TNF-α等进一步增加,显著高于正常肺成纤维细胞;NAC添加能够明显抑制正常肺成纤维细胞在TGFβ1诱导下的趋化因子及细胞因子释放,但对NSIP患者肺成纤维细胞,这种下调作用不明显。③与正常肺成纤维细胞的反应性相反,TGF-β1能够显著提高NSIP患者肺成纤维细胞表达IP-10,NAC能够进一步抑制基态下低水平的IP-10的表达。小结:1. NSIP患者的肺成纤维细胞释放多种趋化因子、炎症细胞因子以及参与纤维化重要的细胞因子的能力较正常肺成纤维细胞显著增加。2. NAC对TGF-β1诱导下系列趋化因子、促炎因子及粘附分子的产生能力具有显著抑制作用,但对NSIP肺成纤维细胞没有明显的抑制作用。3.基态下NSIP患者的肺成纤维细胞表达IP-10的水平明显低于正常肺成纤维细胞,TGF-β1上调了IP-10的表达水平,与TGF-β1能够抑制NSIP肺成纤维细胞高度活化的STAT3信号,下调α-SMA的表达密切相关。