猪流行性腹泻病毒是目前引起我国新生仔猪腹泻的主要病原,该病原主要通过粪口途径感染小肠上皮细胞,从而引发新生仔猪以呕吐、腹泻、脱水、体重减轻以及高病死率为特征的高度传染性疾病,给养猪业造成重大的经济损失。而目前,疫苗是防控该疾病的最佳措施。PEDV疫苗的保护机制主要是诱导机体产生高效的体液免疫应答,所以对B细胞产生抗体免疫应答的深入了解和认识对有效防治PEDV感染具有重要意义。而抗体免疫应答的强大取决于巨大多样性的抗体谱,抗体谱分析已逐步成为评价机体抗体免疫应答的一个重要指标。了解猪的天然抗体谱和免疫后抗原刺激分化的抗体谱对于理解猪的抗体免疫应答机制、疫苗保护机制和新的疫苗研发都非常重要。然而,目前文献报道的主要是胎儿和新生仔猪的天然抗体谱,有关PEDV感染或免疫后的抗体谱尚未有相关研究报道。因此,本研究结合单个B细胞PCR抗体技术和抗体谱高通量测序分析,以国际免疫遗传学数据库为数据分析支撑,从抗体谱解析的角度,对PEDV感染及免疫诱导猪B细胞免疫应答的特性进行了探究和分析。首先本研究从两头具有PEDV高免血清的猪肠系膜淋巴结中分离获取PEDV S抗原特异性B细胞,然后进行单个B细胞PCR扩增抗体基因。最终,该研究从360个#242猪肠系膜淋巴结单个B细胞中获得58条抗体重链可变区基因序列,42条λ轻链可变区序列和51条κ轻链可变区基因序列;从320个#243猪肠系膜淋巴结单个B细胞中获得85条抗体重链可变区基因序列,31条λ轻链可变区基因序列和43条κ轻链可变区基因序列,但体外表达功能性鉴定后均不具有高效中和活性的PEDV抗体。通过对PEDV S抗原特异性抗体基因序列的统计分析,结果发现PEDV S抗原特异性抗体重链、κ轻链和λ轻链基因分别主要使用Ig HV1-4、Ig KV1-11以及Ig LV3-3基因成员,使用频率分别可高达37.93%、96.77%和32.56%,且与猪整体抗体谱具有相似的基因使用多样性和深度,揭示了机体应对PEDV感染时B细胞反应的多样性以及B细胞的克隆选择学说。此外,高通量测序分析结果发现在PEDV免疫后抗体谱中,目前已发现的13种猪抗体重链功能性可变基因、4种猪抗体κ链功能性可变基因家族以及5种猪抗体λ链功能性可变基因家族均可在外周血和肠系膜淋巴结中检测到;Ig HV1S2,Ig KV1-11和Ig LV3-4分别是抗体重链、κ链、λ链的主导基因,使用频率分别可高达24.61%、67.82%和45.50%;虽然肠系膜淋巴结中抗体基因Ig VH1-6和Ig VH1-12的使用频率要高于外周血中,但两组织中抗体谱基因的多样性和使用频率整体上具有较好的一致性,抗体谱并无明显的组织间差异性。同时,为了探究分析PEDV急性感染对仔猪抗体免疫应答的影响,本研究挑选两头PEDVJMS口服感染的5日龄SPF长白仔猪,首先对其进行了肠系膜淋巴结部位的组织病理分析,然后对肠系膜淋巴结、脾和外周血不同组织部位中抗体谱的特征以及PEDV感染前后外周血中抗体基因基因多样性和使用频率的差异性进行分析。苏木精-伊红染色结果显示,PEDV感染的#3和#4猪肠系膜淋巴结中有大量细胞核出现浓缩、崩解,同时一步法TUNEL凋亡检测结果也显示在PEDV感染的猪肠系膜淋巴结中有大量细胞凋亡,且在PEDV感染后2天死亡的#4猪中尤其显著。PEDV感染后不同组织中抗体谱的分析结果发现,13种猪抗体重链功能性可变基因均可在PEDV感染后肠系膜淋巴结、脾和外周血中检测到,且Ig HV1-4和Ig HJ5使用频率最高,抗体重链可变区基因的多样性和分布特征没有明显的组织差异性。在PEDV感染后仔猪κ链基因中仅有Ig KV1和Ig KV2两个基因家族可检测到,其基因多样性相对局限,但基因使用的分布特征在各组织中仍具有较高的一致性,Ig KV1基因家族中主要是Ig KV1-11成员,在Ig KV2基因家族中主要有Ig KV2-6、Ig KV2-8、Ig KV2-10和Ig KV2-13基因成员。在PEDV急性感染的仔猪抗体λ轻链基因的使用中,仅检测到Ig LV3和Ig LV8两个家族的基因成员的表达,且Ig LV3基因家族使用频率高于Ig LV8;Ig LV3家族基因主要有Ig LV3-3和Ig LV3-5成员,Ig LV8家族基因的6个成员在肠系膜淋巴结、脾和外周血中均有表达,但以Ig LV8-10、Ig LV8-13和Ig LV8-18成员为主。而且,相较于脾和外周血,MLN更偏向于Ig LV3-5和Ig LJ2基因的使用。所以,PEDV感染后仔猪的λ轻链基因多样性也具有一定的局限性,且肠系膜淋巴结中基因使用的分布特征与脾和外周血稍有差异。此外,PEDV感染前后外周血中抗体重链基因的分析结果显示,13种重链功能性可变基因在PEDV感染前后均可表达,其多样性无明显差异,但是Ig HV1-6在PEDV感染后外周血中的使用频率显著低于感染前,分别为5.10%和39.10%,而Ig HV1-4和Ig HV1S2在PEDV感染后的使用频率具有升高的趋势。抗体κ链可变区基因的使用特征性分析结果发现,PEDV感染前后均仅可检测到Ig KV1和Ig KV2基因家族的表达,其基因的多样性具有较好的一致性,但是在PEDV感染前,κ链可变基因以Ig KV2基因家族为主,且Ig KV2-10占主要地位,使用频率为40.30%,而在PEDV感染后,κ链可变基因以Ig KV1基因家族为主,Ig KV1-11占显著地位,使用频率为54.31%。同时,针对PEDV感染前后外周血中抗体λ链可变区基因的使用特征,分析发现在PEDV感染前后外周血中均仅检测到Ig LV3和Ig LV8两个基因家族的成员,且Ig LV3基因家族主要有Ig LV3-3和Ig LV3-5成员,Ig LV8基因家族主要有Ig LV8-10、Ig LV8-13和Ig LV8-18基因。但是,Ig LV3-5在PEDV感染前外周血中占有明显的主导地位,使用频率高达72.34%,而在感染后外周血中仅为23.81%。综上,本研究内容详细阐述了PEDV感染或免疫后猪抗体基因的多样性及使用特征,并发现相较于猪PEDV免疫后的整体抗体谱,PEDV S抗原特异性抗体基因对Ig HV1-4、Ig KV1-11、Ig LV3-3具有使用倾向性,但并不具有局限性;猪PEDV免疫后抗体谱中,Ig HV1S2,Ig KV1-11和Ig LV3-4分别是抗体重链、κ链、λ链的主导基因,且外周血和肠系膜淋巴结中的抗体基因具有一致的多样性和使用频率。猪PEDV感染后抗体谱中,抗体重链、κ链、λ链分别以Ig HV1-4和Ig HV1S2、Ig KV1-11和Ig KV2-10、Ig LV3-3和Ig LV3-5为主导基因,且抗体重链和κ链基因多样性及分布特征在肠系膜淋巴结、脾及外周血中具有较好的一致性,但λ链基因在MLN中的分布特征与脾和外周血稍有差异,其更偏嗜于Ig LV3-5和Ig LJ2基因的使用。而在猪PEDV感染前后外周血抗体谱中,抗体可变区基因的多样性没有明显差异,但基因的使用频率却有所不同。因此,本研究工作对猪抗体谱的信息进行了补充和完善,增强了我们对猪B细胞免疫应答的理解和认识,对整个兽医基础免疫学的发展具有非常重要的意义。