论文部分内容阅读
感染人乳头状瘤病毒(HPV)是导致宫颈癌的一个重要因素。宫颈癌在全球每年新发病例约50万,死亡例数约25万,在妇科肿瘤中发病率居第2位。HPV主要感染皮肤以及粘膜鳞状上皮,分为2大类,皮肤型和粘膜型。粘膜型主要感染人泌尿生殖道的黏膜上皮,导致与泌尿生殖器官相关的多种疾病。根据与癌症发生的关系大小,粘膜型HPV分为高危型(HR)和低危型(LR)。高危型主要有HPV-16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和66型；低危型主要有HPV-6,11,40,42,43,44,54,61,70,72,81型。分子流行病学和病毒学研究发现,HPV感染宫颈可发展为宫颈癌与HPV型别有关。在不同国家和地区HPV感染率及其型别分布存在差异,具有很强的地域性,其与宫颈癌相关的型别、E6/E7基因变异情况也不同。关于宫颈癌疫苗的研究,预防性疫苗主要以L1基因为主,治疗性疫苗主要以E6/E7基因为靶点。到目前为止,对于人乳头状瘤病毒(HPV)在西南地区妇女中的流行情况,优势型别以及优势型别的E6/E7基因变异情况的报道很少。本研究旨在探讨中国西南地区妇女HPV感染的分布规律以及HPV-16、18和58型E6、E7基因的变异情况,为评价HPV疫苗接种情况以及筛查与癌症相关的潜在风险因素提供了研究数据,并为下一步研究以HPV E6和E7蛋白为基础的治疗性疫苗提供了重要的实验数据。本论文以中国西南地区妇女门诊病人中正常以及炎症细胞人群(ASC-US,即意义不明的不典型鳞状细胞)和宫颈癌患者为研究对象,调查了该区HPV亚型的感染以及分布。对采集获得2000例妇科门诊宫颈脱落细胞样品以及74例宫颈癌标本开展相关的研究。通过提取基因组DNA,以MY09/MYl1为外引物,GP5+/GP6+为内引物,采用nest-PCR法对样品HPV-DNA高变区L1区的相应基因进行扩增、测序和分型,并对优势型别进行E6和E7基因特异性扩增,测序。E6和E7基因测序后用软件Geneious4.8.4进行比对,将比对的序列上传至GenBank获得基因登录号。用软件Mega4.1使用邻接法(Neighbor Joining,NJ),对E6和E7基因完成进化树分析。应用PAML4.0软件内的位点模型分析E6和E7基因经受正向选择的位点,依卡方x2分布进行似然比值检验。结果表明,中国西南地区妇女ASC-US人群中HPV的流行高危型主要型别为HPV-16型,HPV-58型,HPV-33型；低危型主要为HPV-6型,HPV-11型。宫颈癌患者中以HPV-16,HPV-18型为主。ASC-US人群易感人群为31岁-40岁妇女,宫颈癌患者的易感人群比上述年龄推后10岁。而且,宫颈鳞状细胞癌患者中,HPV-16型为主要感染亚型。通过对E6/E7基因变异分析发现,中国西南地区妇女中HPV-16型E6基因最常见的突变位点为T178G或T178A,即D25E；E7基因常见突变位点为A647G(N29S)和同义突变点T846C。E6/E7基因序列联合分析发现HPV-16型突变位点E6-D25E与E7-N29S-T846C为连锁突变位点,并且为常见变异型。HPV-58型E6基因最常见的突变位点为K93N,E7基因常见突变位点为同义突变点T744G和非同义突变点T20I,G41R,G63S,G63D和V77A,且突变T20I-G63S和突变G41R-G63D为连锁突变位点。HPV-18型E6基因发现T485C和C549A两个同义突变点。进化树分析表明中国西南地区流行的HPV-16E6/E7变异体主要为亚洲型变异体,没有发现非洲1型变异体和非洲2型变异体。HPV-58型E6/E7基因序列起源于东南亚分支。选择压力分析表明,虽然发现HPV-16型E6基因正选择突变位点为32E,E7基因正选择突变位点为29S；HPV-58型E7基因63G为正选择位点,但经过LRT检验,差异没有统计学意义,即没有没有证据表明HPV-16型、HPV-58型E6/E7基因受到正选择。