胶孢炭疽菌多聚类泛素基因CgUbl4的功能研究

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类泛素蛋白(ubiquitin-like proteins,Ubls)广泛存在于真核生物中,在蛋白质降解、细胞周期调控、细胞自噬、氧化应激反应等方面发挥重要作用,它们拥有与泛素蛋白相同的三维结构——泛素折叠或β-抓握折叠(β-grasp fold),能够通过Ubl偶联途径对蛋白质进行共价修饰,多聚类泛素蛋白便是其重要的成员。目前,关于类泛素蛋白的研究主要集中在动植物中,而丝状真菌中类泛素蛋白的功能则鲜有揭示。本研究通过生物信息学分析、基因分离、q RT-PCR技术、酵母双杂交技术、RNAi技术,开展了胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)多聚类泛素Cg Ubl4基因的功能研究,拓宽了对胶孢炭疽菌类泛素蛋白功能的理解,为探索其类泛素化修饰机制奠定基础,主要研究结果如下:1.全基因组数据和生物信息学分析发现,胶孢炭疽菌类泛素Cg Ubls家族有4个成员,三个为类泛素核糖体融合蛋白,分别命名为Cg Ubl1、Cg Ubl2和Cg Ubl3;一个为多聚类泛素蛋白,命名为Cg Ubl4;该家族成员均为亲水性蛋白,均不含有跨膜结构域和信号肽,二级结构以无规则卷曲为主。通过构建系统进化树,发现Cg Ubls家族蛋白具有多样性。2.通过q RT-PCR分析胶孢炭疽菌侵染芒果叶片和果实过程中Cg Ubls家族基因的相对表达量变化,发现Cg Ubl4的相对表达量持续高效上调表达,说明Cg Ubl4参与了病原菌的侵染过程。3.运用STRING version 11.0数据库预测蛋白互作关系,并通过酵母双杂交实验验证了多聚类泛素Cg Ubl4、泛素结合酶Cg UBC22和转录因子Cgb HLH6之间能够两两互作。4.通过RNAi技术获得了Cg Ubl4沉默突变体p Silent-1:Cg Ubl4,比较分析了p Silent-1:Cg Ubl4、p Silent-1:Cg UBC22和p Silent-1:Cgb HLH6三个沉默突变株的表型和致病力。表型测定结果表明,Cg Ubl4、Cg UBC22和Cgb HLH6均参与调控胶孢炭疽菌分生孢子的形态建成、萌发以及附着胞形成,且Cg Ubl4和Cg UBC22还参与调控胶孢炭疽菌菌丝生长、产孢量、盐胁迫耐受性和氧化应激反应。致病力测定结果显示,三个沉默突变株在芒果、苹果和梨上的致病力表现具有一致性,与野生型菌株相比,p Silent-1:Cg Ubl4、p Silent-1:Cg UBC22的致病力显著下降,而p Silent-1:Cgb HLH6的致病力显著增强,说明Cg Ubl4和Cg UBC22正向调控胶孢炭疽菌致病力,而Cgb HLH6则负向调控。本研究发现胶孢炭疽菌多聚类泛素Cg Ubl4参与病原菌的整个侵染过程,与泛素结合酶Cg UBC22和转录因子Cgb HLH6之间能够两两互作,共同调控菌丝生长、分生孢子形成、萌发与附着胞形成,参与调控盐胁迫耐受性、氧化应激反应和致病力。这为多聚类泛素基因调控网络及类泛素化修饰机制的研究奠定基础,也为类泛素化蛋白抑制剂类药物的研发提供新的策略。
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