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肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是成年发病的以大脑运动皮层、脑干和脊髓中运动神经元受累为特征的神经变性疾病。流行病学显示,绝经期前男性发病率明显高于女性,约为3-4:1,绝经后这种差异减小,男女发病率约为1:1。研究发现,雄性SOD1G93A转基因小鼠发病时间早于雌性小鼠,卵巢摘除使小鼠寿命缩短,摘除卵巢后给予雌二醇明显延缓疾病进展。流行病学研究及实验研究均提示雌激素对ALS的发病及进展可能有保护作用。雌激素(Estrogen,E)是一种甾体类固醇性激素。除参与生育、性活动外,近年来发现雌二醇与其受体(estrogen receptor,ER)包括核受体ERα及β及膜受体GPR30结合后,调控基因表达、激活APMK、Akt通路,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用,从而发挥的神经保护作用。以往的研究多集中于AD、PD及卒中等发病过程中雌激素的脑保护机制研究,而对脊髓疾病的保护机制则集中于急性脊髓损伤、多发性硬化及体外的单细胞保护的研究,对肌萎缩侧索硬化的神经保护机制未见报道。如上所述,雌激素的生物功能主要由与受体结合后完成,以往研究发现ERα及ERβ在脊髓主要在后角I-III层表达,参与痛觉调节,而在脊髓前角的分布未见系统的描述,为了研究雌激素的保护机制需要全面了解其受体的表达特征。基于此,本实验应用免疫组化及激光共聚焦的方法观察,雌激素核受体在SOD1G93A转基因鼠腰段脊髓表达特征,为进一步研究雌激素在ALS发病过程中的神经保护作用提供理论依据及可能的靶点。本研究分为两部分,内容如下:第一部分ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角的表达特征目的:观察ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角运动神经元的表达。方法:1实验动物成年雄性CD1小鼠2免疫组化10%水合氯醛将成年雄性小鼠麻醉后,心脏灌注4%多聚甲醛固定20min,取小鼠脊髓腰段以4%多聚甲醛固定48h,振动切片25μm厚,免疫组织化学法观察ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角运动神经元的表达特征。3免疫荧光染色将固定好的腰段脊髓震荡切片成25μm厚,应用免疫荧光染色的方法在激光共聚焦显微镜下观察ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角运动神经元的细胞定位。结果:在成年雄性小鼠腰段脊髓,ERα在前角中有表达,表达部位主要位于运动神经元,且胞核高表达,胞浆中量表达。免疫荧光染色证实是α-运动神经元。结论:ERα在成年雄性小鼠脊髓前角运动神经元的胞核高表达,在胞浆中量表达。第二部分ERβ在SOD1G93A转基因鼠腰段脊髓表达特征目的:观察不同病变时期SOD1G93A转基因小鼠ERβ的表达特征。方法:1模型建立及分组饲养繁殖家族性肌萎缩侧索硬化动物模型SOD1G93A转基因鼠,分为症状前期(相当于60天)、症状期(相当于90天)及终末期(相当于120天)3组,同窝别未转基因的为对照组,每组各3只小鼠。2取材实验动物经10%水合氯醛腹腔内麻醉后,4%多聚甲醛经心脏灌注固定20min,留取小鼠脊髓腰膨大,在4%多聚甲醛固定48h。3免疫组化染色固定后的组织块震荡切片25μm厚,应用免疫组织化学SP法进行染色,观察ERβ在SOD1G93A转基因小鼠及对照组小鼠各时期腰段脊髓前角的表达特征。计数双侧脊髓前角ERβ免疫阳性α运动神经元的数量。4免疫荧光染色4%多聚甲醛固定的组织块震荡切片25μm厚,应用免疫荧光染色法进行染色后在激光共聚焦显微镜下观察SOD1G93A转基因小鼠腰段脊髓ERβ的细胞定位。5统计学处理采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行统计处理。采用均数±标准差表示腰段脊髓切片两侧脊髓前角α运动神经元计数之和,三组数据的比较采用单因素方差分析,两组数据的比较采用两个独立样本比较的t检验,以P=0.05为显著性检验标准。结果:1 SOD1G93A转基因鼠的鉴定子代鼠基因组DNA经PCR扩增后、在GBOX-HR全自动凝胶成像系统下其琼脂糖凝胶电泳,m SOD1的PCR产物为236bp,若200-300bp之间的有条带,则该小鼠为SOD1G93A转基因鼠,若无此条带,则为非SOD1G93A转基因鼠,即阴性小鼠。2 ERβ免疫组化2.1 ERβ在对照组小鼠脊髓灰、白质均有表达,主要表达于细胞核;灰质表达较白质更明显;脊髓后角I-III层高表达,脊髓前角广泛表达,但表达密度较低。SOD1G93A转基因鼠症状前期腰段脊髓ERβ的表达方式及强度与对照组无明显区别。2.2随着病情进展,SOD1G93A转基因鼠脊髓前角ERβ免疫阳性α运动神经元数目逐渐减少,在症状前期、发病早期、终末期分别为24.30±1.25、14.40±1.50、3.1.±2.28,且各病变时期间均有显著性差异(P<0.05);而对照组分别为23.40±3.17、24.00±1.70、22.20±1.32,各时期间无显著性差异(P>0.05)。发病早期、终末期SOD1G93A转基因鼠组与对照组相比均有统计学差异(P<0.05)。3免疫荧光染色ERβ在小鼠脊髓前角α运动神经元及星型胶质细胞、小胶质细胞的胞核均有表达,脊髓前角α运动神经元胞浆少量表达。随病程的进展,SOD1G93A转基因鼠脊髓前角ERβ免疫阳性的运动神经元数目逐渐减少,反应性星形胶质细胞及小胶质细胞的胞核也有ERβ表达。结论:1 ERβ在小鼠脊髓前角α运动神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞均有表达,主要为核表达,在运动神经元胞浆有少量表达。2 SOD1G93A转基因鼠随着病程进展,脊髓前角ERβ免疫阳性α运动神经元数目逐渐减少,反应性星形胶质细胞及小胶质细胞也有ERβ的表达。