单宁酰基水解酶,通常称为单宁酶,可以催化水解单宁酸和没食子酸酯类中的酯键、缩酚酸键和糖苷键,生成没食子酸和葡萄糖,在食品、饲料、医药、化工等行业有着广泛的应用,特别是在速溶茶行业。在绿茶的提取过程中添加单宁酶,能够水解茶汤中的水解单宁,不仅可以提高绿茶茶汤的滋味品质,还可以促进茶汤澄清。因为绿茶汤的提取等操作一般在高温条件下进行,所以研究高温条件单宁酶蛋白分子空间结构和催化活性的变化情况很有必要。本文以黑曲霉单宁酶为研究对象,对单宁酶进行分离纯化;研究高温对该单宁酶活性及蛋白分子空间结构的影响,对其热失活过程建模验证并研究温度对其催化动力学常数和热力学常数的影响。主要研究结果如下:（1）采用10 kDa超滤膜超滤浓缩、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析及Sephadex G-100凝胶柱层析分离纯化后,得到电泳纯的单宁酶,其比酶活为57.956 U/mg,纯化倍数为5.101,酶活回收率为50.44%。（2）纯化后的单宁酶最适反应pH为5.0,pH稳定性范围为3.0-7.0;最适反应温度为45℃,温度稳定性范围为20-50℃。圆二色谱结果表明,单宁酶的主要二级结构是β结构,随着处理温度的升高,α-螺旋比例减少,无规则卷曲比例增大,说明单宁酶的稳定性随着温度的升高逐渐变差;傅里叶红外光谱结果表明,经过40℃处理的单宁酶分子未出现明显的特征吸收波长迁移的现象,而经过70℃处理的单宁酶分子的主要特征吸收峰发生明显的蓝移,说明高温处理后单宁酶结构中的基团稳定性下降;荧光光谱结果表明,随着处理温度的升高,单宁酶的荧光强度逐渐减弱,而且伴随着红移的现象,说明高温会导致蛋白质三级结构发生一定程度的改变。（3）单宁酶在40℃时,米氏常数K_m最小;温度为45℃时k_cat/K_m最大,单宁酶水解单宁酸的效率最高;温度大于45℃,随着温度的升高催化效率下降,这可能是因为温度过高会造成单宁酶一定程度的失活而导致的。对单宁酶的热失活过程进行D-值和z-值建模,并进行实验验证,结果显示预测值与实验值之间的相对误差值很小,说明模型的准确度较高。对单宁酶的热失活动力学参数进行计算,结果表明:在同一底物浓度条件下,随着温度的升高,失活速率常数k呈现增大的趋势,半衰期t_1/2呈现下降的趋势,说明单宁酶的稳定性随着温度的升高逐渐变差。温度系数为1.0,说明温度是影响单宁酶酶促反应的主要因素。计算高温条件下单宁酶的热力学参数,结果显示:不同温度下单宁酶酶促反应的ΔG均大于0,说明单宁酶与底物单宁酸进行结合时,反应不能自发进行,需要外界提供能量才能达到过渡态;单宁酶的ΔH大于0且ΔH值随温度的升高而减小,说明单宁酶催化水解反应为吸热过程;单宁酶的ΔS值均小于0,且ΔS值随温度的增大呈现出逐渐增大的趋势,说明单宁酸在单宁酶活性中心的定向有序性随温度的升高逐渐变差,单宁酶的催化性能减弱。以上所有的实验结果表明,高温处理会导致单宁酶蛋白分子空间结构发生改变,通过热失活模型及温度对单宁酶失活动力学参数的影响研究,结果表明随着温度的升高,单宁酶的催化活性和热稳定性逐渐下降。