背景遗传性包涵体肌病(HIBM)特指包涵体肌病2型(IBM2),也称伴镶边空泡的远端肌病(DMRV),是常染色体隐性遗传的以股四头肌不受累为特点的远端肌病。临床表现为成年早期下肢远端肌无力起病；10～20年间缓慢进展；但股四头肌相对不受累直至疾病晚期。肌肉病理表现为镶边空泡形成和成群小纤维；没有明显的坏死和炎症浸润；电镜下可见直径15～20nm的管状细丝包涵体。疾病由定位于9p13.2的UDP(尿苷二磷酸)-N-乙酰葡糖胺-2-表异位酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(GNE)基因突变导致。该基因编码的UDP(尿苷二磷酸)-N-乙酰葡糖胺-2-表异位酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(GNE/MNK)是广泛表达的可溶性蛋白,定位于胞浆、高尔基体及细胞核内,在唾液酸(Neu5Ac)生物合成中起关键作用。Neu5Ac是最丰富的哺乳动物唾液酸,其活化形式一磷酸胞嘧啶唾液酸(CMP-NeuAc)由高尔基复合体内的唾液酸转位酶催化对糖结合物进行唾液酸化,是糖结合物经典的末端单糖,在细胞信号转导功能中起到重要作用。尽管致病基因已经确定,但遗传性包涵体肌病的病理机制仍未完全阐明。遗传性包涵体肌病相关的GNE基因突变导致两种酶功能活性的减低,唾液酸产生减少。尽管HIBM患者细胞是否存在低唾液酸化研究结果不一,而且低唾液酸化是否能导致肌病仍存有争议,低唾液酸化仍是HIBM的发病机制的关键因素。研究表明N联接的比其他如0联接的或PSA联接的糖化合物更容易唾液酸化。因此当唾液酸不足时,某些特异蛋白质如PSA-NCAM或α-肌营养不良相关蛋白聚糖(a-dystroglycan, α-DG)糖基化不充分,可能对HIBM的病理起到作用。唾液酸是糖化蛋白重要的末端单糖,对蛋白质的正确折叠起到关键的作用。而低唾液酸化则在一定程度上干扰蛋白质的正确折叠,形成错误折叠蛋白。淀粉样蛋白本身即是糖蛋白,当唾液酸含量降低的时候,可以导致淀粉样蛋白的错误折叠并在内质网中聚集。目前仅在少数肌病中发现肌纤维内淀粉样蛋白沉积,其中即有遗传性包涵体肌病和散发性包涵体肌炎。散发性包涵体肌炎除了炎细胞浸润以外在病理上与遗传性包涵体肌病改变非常相似。而淀粉样蛋白在散发性包涵体肌炎中的作用已在其小鼠模型上被证实,淀粉样蛋白沉积程度与肌无力相关。淀粉样蛋白沉积在遗传性包涵体肌病小鼠模型中被证实是其病理进程中早于镶边空泡及包涵体形成出现的上游事件。淀粉样蛋白在肌纤维内沉积是遗传性包涵体肌病显著关键的上游病理改变,但是淀粉样蛋白沉积的后继反应及其如何导致镶边空泡等遗传性包涵体肌病典型病理特征的出现,其机制仍不明确。异常折叠的蛋白产生并滞留于内质网,对细胞的生存是内在的威胁。异常折叠蛋白有凝集倾向并显著影响氧化还原状态、游离钙离子水平和膜的渗透性导致细胞的损伤和最终死亡。除了热休克家族的分子伴侣能结合并辅助非折叠蛋白重新折叠以外,泛素蛋白酶体系统通过参与内质网相关蛋白降解路径(ERAD)为保护细胞免受蛋白错误折叠并聚集的损害发挥重要作用。异常折叠的蛋白质的清除依赖其在内质网内被识别并转运至胞浆进行降解。而AAA-ATPase Cdc48/p97即含缬氨酸蛋白(valosin containing protein, VCP)承担了将错误折叠的内质网蛋白转运至胞浆中的功能。VCP能够锚定在内质网膜上并通过底物募集因子与膜上的泛素化底物相结合。VCP内紧密相互配合的构象改变导致ATP水解产生能量将泛素化底物转运至胞浆内由蛋白水解酶进行降解。26S蛋白酶体系统由一个20S催化核心和两个19S调节复合体组成,是一个700kd的多亚基蛋白酶复合体,存在于真核细胞胞浆和核内。26S蛋白酶体通过泛素介导的ATP依赖的方式,对正常和非正常蛋白质降解起到重要作用。19S亚基介导多泛素化蛋白的识别,使其能够接近20S降解核心。20S催化核心由α和p两种亚基组成。β亚基含有胰蛋白酶样(trypsin-like, T-L)、胰凝乳蛋白酶样(chymotrypsin-like, CT-L)及肽基谷氨酰肽水解酶(PGPH-Like)活性。26S蛋白酶体系统涉及多种蛋白质降解,包括泛素化的错误折叠和非折叠蛋白质。然而寡聚化和聚集的非折叠蛋白因无法通过泛素蛋白酶体系统狭窄的孔径而不能被其降解。此时能够降解大块的包括完整的细胞器的自体吞噬系统对蛋白凝集体的清除尤为重要。泛素蛋白酶体系统与自体吞噬溶酶体系统是蛋白质降解径路中的两大基石,参与到正常的生理和发育以及包括癌症,神经退行性和老化等一系列病理状态。泛素蛋白酶体系统和自体吞噬溶酶体系统涉及到几乎所有多余的无功能或有害细胞成分包括可溶性蛋白和整个细胞器的最终降解。自体吞噬系统和泛素蛋白酶体系统对于维持细胞稳态至关重要,提示他们的活性需要精细的协调。然而这两条路径无论在作用机制上(自体吞噬是囊泡转运路径而泛素蛋白酶体系统的酶促反应直接发生于胞浆内)还是在底物(泛素蛋白酶体系统仅限于可溶性蛋白,而自体吞噬系统则不局限于可溶性蛋白),以及特异性、控制因素上都有显著的不同。因此很长时间以来,泛素蛋白酶体系统与自体吞噬溶酶体系统被认为是互相独立的无关联的两大径路。然而,最近越来越多的证据表明这两大降解系统之间存在着意想不到的相互作用和影响。自体吞噬溶酶体系统曾被认为是非选择性的大批量降解胞浆蛋白和细胞器的蛋白降解径路。随后越来越多的证据提示泛素蛋白酶体系统和自体吞噬系统在细胞应激时保持重要的协调互补的关系。尤其是这些降解系统共有特定的底物和调节分子,某些情况下显示协调的互补的功能。尽管目前自体吞噬溶酶体系统和泛素蛋白酶体系统功能如何协调仍然未知,但是某些调节因子在介导这些相互作用上显示出重要的作用,包括组蛋白脱乙酰基酶6(histone deacetylase6, HDAC6)、 p62(sequestosome1)和NBR1(neighbor of BRCA1gene)。HDAC6可以通过一个高度保守的锌指结构与多泛素化蛋白相结合,同时与动力蛋白相联系,在泛素化底物与转运系统之间起到物理连接的作用。p62是另一种结构显示可以作为泛素化蛋白和自体吞噬机制相联系的调节分子的胞浆蛋白。p62的碳末端有一个能够与泛素化蛋白以非共价键方式结合的泛素相关(ubiquitin associated, UBA)结构域以及一个LC3交联域(LC3interacting region, LIR)。2细胞应激如多谷酰胺表达、蛋白酶体损伤、氧化应激和错误折叠蛋白增加都能激活p62的转录和翻译,提示其在应激状态下广泛发挥功能。p62在自体吞噬溶酶体系统和泛素蛋白酶体系统之间通过辅助自体吞噬溶酶体降解泛素化底物起到重要连接作用。NBRl是参与自体吞噬溶酶体路径降解泛素化蛋白的重要的具有泛素结合能力的骨架蛋白。最新的实验研究表明NBRl是另外一个能携带泛素化蛋白至自体吞噬溶酶体系统内进行降解的载体蛋白,也是自体吞噬溶酶体系统底物的受体随其一起被自体吞噬溶酶体系统降解。NBR1在选择性自体吞噬溶酶体降解泛素化蛋白底物时协同p62共同作用,并且其与p62存在物理上的联系,但是二者仍能够相互独立的发挥作用。遗传性包涵体肌病肌肉活检中最具典型意义的镶边空泡实际上是自体吞噬空泡和髓样小体的聚集。自体吞噬溶酶体系统在遗传性包涵体肌病中激活已被大量的研究及实验证实。在镶边空泡纤维内观察到的酸性磷酸酶初级溶酶体、dathrin阳性颗粒和组织蛋白酶B和L证实了这些空泡的自体吞噬本质。然而导致镶边空泡形成的精确机制以及这两大降解系统在遗传性包涵体肌病发病机制中的相互联系及作用仍不明了。为此,我们对临床和肌肉病理特点符合HIBM诊断的中国患者进行了GNE基因序列分析,筛选GNE基因确诊的中国人HIBM患者。本研究将对基因确诊的中国HIBM患者肌纤维内淀粉样蛋白沉积及肌细胞的反应做进一步研究,探讨非正常折叠蛋白质从内质网向胞浆转运及泛素蛋白酶体系统的激活在遗传性包涵体肌病的发病机制中的作用。同时通过对联系泛素蛋白酶体系统与自体吞噬溶酶体系统的调节分子HDAC6、p62和NBR1的表达研究来探讨泛素蛋白酶体系统的激活及其与自体吞噬溶酶体系统在遗传性包涵体肌病的发病机制中的相互关联。材料和方法材料：从山东大学齐鲁医院神经肌肉病研究室临床、肌肉病理及电镜诊断为遗传性包涵体肌病患者的肌活检标本中提取基因组DNA进行GNE基因测序分析。共筛选出10例GNE基因确诊的遗传性包涵体肌病患者(前7例患者为之前已经DNA测序证实的HIBM患者,后3例为新近诊断并经DNA测序证实的患者)。选取5例因抽搐拟诊线粒体脑肌病并最终经肌肉活检病理及mtDNA基因检测证实非肌病患者肌肉组织作为正常对照。方法：1.从肌肉组织中提取其基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)方法特异性扩增GNE基因编码区各外显子及其侧翼序列。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,经分离纯化后通过DNA测序方法获得其序列,然后与正常序列进行比对分析,了解各患者GNE基因的突变形式。明确突变碱基后,检测是否发生氨基酸序列改变并定位。对新发现的突变采用错配引物扩增,内切酶酶切限制性片段多态性来检测100例无血缘关系的健康正常人予以验证。2.免疫荧光染色：经液氮预冷的异戊烷中速冻的冰冻肌肉标本制成4μm冰冻切片,用含有1%BSA的封闭液进行封闭,然后一抗孵育,PBS清洗后用罗丹明标记的二抗进行处理。碳酸氢钠甘油缓冲液封片后用荧光显微镜采集图像。3. Western Blot:将经液氮预冷的异戊烷中速冻的冰冻肌肉切10μm共约50薄片采用细胞裂解液提取肌肉组织总蛋白。取20至60ug蛋白与蛋白Marker一起上样。在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳后,转移至硝酸纤维素膜(NCV)上。电转膜采用5%脱脂牛奶封闭,一抗孵育4℃过夜,PBST清洗三遍后,使用HRP标记二抗37℃孵育1小时。ECL曝光显色。蛋白定量用Quantity One软件进行,以目的蛋白与a-actin或GAPDH条带积分光密度的比值表示蛋白表达相对值。4.蛋白酶体主要蛋白酶活性测定：使用特殊的细胞裂解液提取肌肉总蛋白并使用BCA法测蛋白浓度。将200μg所提取的活检肌组织蛋白与100μmol/L的特异性产荧光底物(底物Ⅱ检测PGPH酶活性；底物Ⅲ检测CT-L酶活性；底物ⅣV检测T-L酶活性)37℃孵育1小时。采用360nm荧光激发及430nm记录光密度值。5.实时定量PCR：冰冻切片机内将速冻肌肉标本切5μmm薄片约30片于去RNAase EP管内。采用Trizol提取肌肉组织总RNA。mRNA应用Tiangen逆转录试剂盒逆转录成cDNA。应用SYBR Green I试剂盒进行荧光实时定量PCR。采用目的基因与β-actin循环闽值(threshold cycle, Ct)的比值并通过公式2△ct(△Ct=β-actin Ct-target gene Ct)表示mRNA的相对水平。结果1.3例新近临床诊断HIBM患者经GNE测序分析发现1例p.1587T纯和突变和两例复合杂合突变,其中一例为p.Y166H与p.D515fsX2复合杂合突变,一例为p.D176V与p.V305F复合杂合突变。p.Y166H和p.V305F为2个新发现点突变,p.D515fsX2为新发现缺失框移突变。两个新发现点突变的限制酶切图谱显示100例正常对照人群中不存在该点突变。2.淀粉样蛋白前体蛋白在遗传性包涵体肌病肌纤维内聚集。淀粉样蛋白前体蛋白在肌纤维内聚集主要以两种形态存在：呈斑片样聚集于萎缩小纤维内及以类圆形凝集体形态存在于大致正常肌纤维内。正常对照肌肉组织内仅见间质内非特异性染色。3. VCP高表达促进异常折叠蛋白从内质网转运至泛素蛋白酶体系统。免疫印迹蛋白分析遗传性包涵体肌病患者VCP表达较正常对照组织增加108.3%(P<0.05),实时定量PCR分析遗传性包涵体肌病患者较正常对照组织表达增加215.6%(P<0.05)。4.蛋白酶体亚基表达增加,泛素蛋白酶体系统激活。免疫印迹分析遗传性包涵体肌病患者蛋白酶体亚基α2、α4和β5分别较正常对照增加162.3%、66.3%和51.7%(P<0.05)。实时荧光定量PCR分析显示遗传性包涵体肌病患者蛋白酶体亚基α2、α4和β5分别较正常对照增加156.4%、56.7%和96.3%(P<0.05)。泛素蛋白酶体主要亚基在mRNA水平和蛋白水平均表达增加,提示泛素蛋白酶体系统在遗传性包涵体肌病患者肌肉组织中活化。5.蛋白酶体系统三种主要蛋白酶活性增强。遗传性包涵体肌病患者肌肉组织内蛋白酶体系统三种主要的蛋白酶活性：胰凝乳蛋白酶样活性、胰蛋白酶样活性和肽-谷氨酰肽水解酶样活性较正常对照分别增高48.2%、55.3%和27.5%(P<0.05)。6.免疫印迹分析泛素蛋白酶体系统与自体吞噬溶酶体系统联系因子HDAC6在遗传性包涵体肌病患者肌组织内表达较正常对照增加98.6%(P<0.05)。实时荧光定量PCR分析泛素蛋白酶体系统与自体吞噬溶酶体系统联系因子HDAC6在遗传性包涵体肌病患者肌组织内表达较正常对照增加135.4%(P<0.05)。7.免疫印迹分析泛素蛋白酶体系统与自体吞噬溶酶体系统联系因子p62在遗传性包涵体肌病患者肌组织内表达量较正常对照组织增加124.8%(P<0.05)。实时荧光定量PCR分析泛素蛋白酶体系统与自体吞噬溶酶体系统联系因子p62在遗传性包涵体肌病患者肌组织内表达量较正常对照组织增加64.5%(P<0.05)。8.免疫印迹分析泛素蛋白酶体系统与自体吞噬溶酶体系统联系因子NBR1在遗传性包涵体肌病患者肌组织内表达较正常对照增加149.2%(P<0.05)。实时荧光定量分析泛素蛋白酶体系统与自体吞噬溶酶体系统联系因子NBR1在遗传性包涵体肌病患者肌组织内表达较正常对照增加95.1%(P<0.05)。结论1.中国遗传性包涵体肌病患者临床表型高度一致,而GNE基因突变形式复杂多样,且GNE基因检测结果与临床诊断具有较高的一致性。中国遗传性包涵体肌病人群可能的热点突变为p.L508S。2.在遗传性包涵体肌病患者小的变性萎缩肌纤维内见斑片状β-APP的聚集,提示细胞内过量异常折叠蛋白的聚集可能是导致肌纤维退行性变的原因。类圆形β-APP在正常大小肌纤维内聚集提示淀粉样蛋白沉积为遗传性包涵体肌病病理过程中的上游事件。3.VCP在遗传性包涵体肌病患者肌肉组织中表达增高促进异常折叠蛋白从内质网向泛素蛋白酶体转运增加。泛素蛋白酶体亚基在遗传性包涵体肌病患者肌肉组织中表达增加以及三种主要的泛素蛋白酶体酶活性增加提示泛素蛋白酶体系统激活参与内质网相关蛋白降解径路。4.泛素蛋白酶体与自体吞噬溶酶体系统联系蛋白表达含量在遗传性包涵体肌病患者肌肉组织内显著增加提示泛素化底物由泛素蛋白酶体系统向自体吞噬溶酶体系统转运增加。泛素蛋白酶体系统与自体吞噬溶酶体系统在遗传性包涵体肌病肌纤维内异常折叠蛋白的清除中共同发挥作用。自体吞噬溶酶体系统很可能在泛素蛋白酶体系统不能降解全部异常沉积蛋白时作为唯一可能的弥补途径参与其降解。5.内质网相关蛋白降解通路中泛素蛋白酶体系统激活并且与自体吞噬溶酶体系统相互协调共同促进异常折叠蛋白质的降解参与遗传性包涵体肌病发病机制,可能为遗传性包涵体肌病的干预治疗提供新的治疗靶点。