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背景:肌少症是老年的常见高发病,其特征表现为随着年龄的增长肌肉质量减少和肌力下降。根据临床病例报道,肌肉减少的个体常伴随脂肪质量增加,特别是在肌肉和内脏隔室,人们将存在绝对或相对较低的肌肉质量加上体重指数大于30或总体重偏高的疾病称为“肌少性肥胖”。另一部分观点则认为肥胖不仅是肌少症的伴形病,很可能是肌少症的重要诱因。很多肥胖相关的异常病变同时参与肌肉的生长调节。基于以上两方面观点,肥胖与肌少症的因果关系及肥胖是否能够诱发肌肉萎缩有待进一步明确。自噬是一种细胞内降解过程,其中受损的细胞器和长寿命蛋白质被降解,并回收用于维持正常的细胞内稳态。然而自噬的过度激活会导致许多代谢性疾病及相关并发症的发生。在脂肪组织中靶向缺失Atg7的小鼠中,脂肪量显著减少,且这类小鼠的白色脂肪组织呈现出棕色脂肪组织的特征,有助于增强胰岛素敏感性。已有研究表明自噬进程中的一些关键组成部分在肌肉萎缩期间转录上调,其诱导先于肌肉萎缩。骨骼肌特异性基因敲除Atg7小鼠葡萄糖清除率和能量消耗增加。而自噬及自噬途径关键蛋白Atg7是否在肥胖诱发的肌肉萎缩中发挥调控作用尚未可知。Akt是肌蛋白合成与降解途径的共同调控因子:在促进肌蛋白合成方面,成年人肌纤维中过表达Akt可完全阻断失神经诱导的肌肉萎缩。骨骼肌中过表达Akt通过m TOR控制蛋白质合成,m TOR是细胞生长所需的胰岛素和营养敏感途径的关键激酶下游。在抑制肌蛋白降解方面,Akt通常通过负调控Fox O转录因子进而阻断肌肉组织特异性泛素连接酶,Atrogin-1和TRIM63的增加。因此,维持Akt活性是改善肌肉萎缩的重要靶点。目的:本研究旨在明确肥胖是肌肉萎缩的诱导因素,并进一步阐明自噬相关蛋白Atg7在肥胖诱发肌肉萎缩的作用机制。材料与方法:1、第一部分:本部分选取成年小鼠为研究对象,给予高脂饮食刺激不同时长,检测糖耐量、血清学指标、体脂分布评估肥胖造模情况;利用小鼠抓力仪、小鼠周期疲劳测试仪检测小鼠抓力、耐力评估小鼠骨骼肌行为学能力;检测腓肠肌重量及指数,和利用苏木精-伊红染色评估小鼠骨骼肌形态学病变,以此明确高脂饮食对骨骼肌萎缩的潜在影响。2、第二部分:本部分研究使用Western blot检测了高脂喂养20周的肥胖小鼠腓肠肌Atg7/LC3/p62自噬通路及Akt/Fox O3a/TRIM63/My HC肌蛋白降解通路明确自噬通路激活情况;进一步通过注射腺相关病毒敲低腓肠肌Atg7表达,实验分为四组:WT-ND组（注射sh NC腺相关病毒给予正常饮食）、Atg7△SM-ND组（注射sh Atg7腺相关病毒给予正常饮食）、WT-HF组（注射sh NC腺相关病毒给予高脂饮食）、Atg7△SM-HF组（注射sh Atg7腺相关病毒给予高脂饮食）。利用小鼠抓力仪、小鼠周期疲劳测试仪检测小鼠抓力、耐力评估各组小鼠骨骼肌行为学能力;检测腓肠肌重量及指数,和利用苏木精-伊红染色评估各组小鼠骨骼肌形态学病变,Western blot检测了各组小鼠腓肠肌上述通路,探讨自噬相关蛋白Atg7是否参与肥胖能够诱发肌肉萎缩进程调控。3、第三部分:本部分利用棕榈酸刺激小鼠骨骼肌细胞C2C12构建体外细胞模型,并在此基础上过表达和敲低Atg7,Western blot检测了各组细胞上述通路;免疫荧光检测My HC蛋白表达明确Atg7针对肌细胞萎缩的调控作用。利用放线菌酮及MG132或CQ处理棕榈酸刺激的C2C12细胞,并联合Atg7干预评估Atg7对My HC的半衰期及降解影响,明确Atg7调控肌蛋白降解的主要途径。利用棕榈酸刺激的C2C12细胞,并联合Atg7敲低、Akt敲低或Akt磷酸化抑制剂MK2206,Western blot检测了各组细胞Akt/Fox O3a/TRIM63/My HC肌蛋白降解通路;利用GST-Pulldown检测Atg7与Akt蛋白结合,利用免疫共沉淀检测棕榈酸刺激的C2C12细胞Atg7与Akt结合变化,明确Atg7调控Akt的作用方式。解析Atg7通过抑制Akt磷酸化调控肥胖诱发肌萎缩的作用机制。数据（n＞6）以平均值±SEM表示,数据（n≤6）以平均值±SD表示,t检验则用于两组间比较,三组及以上比较采用One-way或Two-way ANOVA。P＜0.05代表数据结果具有统计学意义,P＜0.01代表数据结果存在显著统计学差异。使用单向或双向方差进行分析,使用SPSS软件（Windows版本13.0）进行事后bonferroni检验以确定组间的个体差异。统计图采用Graph Pad Prism version 5.01分析。结果:1、第一部分:本部分研究首先采用高脂饮食构建肥胖模型。从第三周开始,高脂饮食组（HF组）小鼠体重显著高于正常饮食组（ND组）,血清甘油三酯（P＜0.05）和总胆固醇含量（P＜0.05）显著高于正常饮食组,且高脂饮食20周后,趋势进一步扩大。高脂饮食20周小鼠空腹血糖显著高于正常饮食组（P＜0.05）,120min内糖耐量曲线及曲线下面积相较于正常饮食组显著增加（P＜0.01）。体脂分布结果显示高脂饮食8周和20周,小鼠瘦体重均显著低于正常饮食组（P＜0.05）。从高脂饮食8周开始,腓肠肌重量（P＜0.05）和腓肠肌指数（P＜0.01）均显著低于正常饮食组。H＆E染色结果显示高脂喂养8周小鼠与正常饮食组小鼠肌纤维横截面和肌纤维数目显著降低,肌纤维排列存在明显间隙。高脂喂养20周小鼠与正常饮食组小鼠肌纤维横截面和肌纤维数目均显著降低,肌纤维排列松散、且存在较大间隙。小鼠抓力和耐力检测结果显示给予高脂饮食8周起,小鼠抓力、跑轮时间明显低于正常饮食组。2、第二部分:本部分研究首先使用Western blot检测了高脂喂养20周的肥胖小鼠腓肠肌Atg7/LC3/p62自噬通路及Akt/Fox O3a/TRIM63/My HC肌蛋白降解通路,结果显示HF组腓肠肌内TRIM63含量显著增加（P＜0.01）,My HC含量显著下降（P＜0.05）,p-Akt/Akt、p-Fox O3a/Fox O3a比值均显著下降（P＜0.05）,Atg7、LC3-II/I比值、p62均显著增加（P＜0.01）。采用sh Atg7腺相关病毒注射于曝露的腓肠肌组织,构建腓肠肌Atg7敲低高脂小鼠模型,发现Atg7△SM-HF小鼠瘦体重增加（P＜0.01）、脂肪分布下降（P＜0.01）,小鼠腓肠肌质量（P＜0.05）和小鼠腓肠肌指数（P＜0.01）增加。H＆E染色结果显示Atg7△SM-HF小鼠腓肠肌肌纤维均排列,肌纤维横截面积（P＜0.01）和肌纤维数目（P＜0.01）较WT-HF组明显增加,小鼠跑轮时间（P＜0.01）、跑轮距离（P＜0.01）和抓力（P＜0.01）较WT-HF组明显增加。信号通路检测结果显示Atg7△SM-HF小鼠较WT-HF组TRIM63含量显著下降（P＜0.01）,My HC含量显著增加(P＜0.01,p-Akt/Akt、p-Fox O3a/Fox O3a比值均显著增加（P＜0.05）。3、第三部分:本部分研究首先采用0.75 m M棕榈酸刺激C2C12细胞24 h和48 h,检测上述信号通路,结果显示棕榈酸刺激下,TRIM63含量显著增加,My HC含量显著下降,p-Akt/Akt、p-Fox O3a/Fox O3a比值均显著下降,Atg7、LC3-II/I比值、p62均显著增加。过表达Atg7导致p-Fox O3a和p-Akt蛋白表达显著降低,TRIM63表达显著增加,肌蛋白My HC显著降低,My HC免疫荧光显示肌细胞直径显著缩短（P＜0.01）;敲低Atg7会导致棕榈酸刺激下的p-Fox O3a和p-Akt蛋白表达增加,TRIM63表达显著下降,肌蛋白My HC显著增加,敲低Atg7会部分改善棕榈酸刺激下的肌细胞直径缩短,维持肌细胞直径（P＜0.01）。使用蛋白合成酶抑制剂放线菌酮处理0-2 h,对照组My HC在放线菌酮处理1 h后便显著下降,推测其半衰期在0.5-1 h,而敲低Atg7后,My HC半衰期大于2 h。棕榈酸刺激会引起My HC蛋白降低,分别给予蛋白酶体抑制剂MG132和自噬溶酶体抑制剂CQ后,给予MG132组My HC蛋白重新累积,而单独给予CQ则对棕榈酸刺激下的My HC蛋白降解无改善作用,过表达Atg7会显著刺激My HC表达下降,而给予蛋白酶体抑制剂MG132后则会重新累积。转染sh Akt质粒发现敲低Akt会导致p-Fox O3a的下降和棕榈酸刺激下的TRIM63激活;敲低Atg7同时敲低Akt,Fox O3a介导的TRIM63通路被重新激活,且肌蛋白My HC表达下降;在敲低Atg7同时给予MK2206,Fox O3a介导的TRIM63通路被重新激活,且肌蛋白My HC表达下降。GST-Pulldown结果显示Atg7与Akt存在体外直接结合,免疫共沉淀结果显示棕榈酸刺激下二者结合增加,且p-Akt表达降低。结论:1.高脂饮食导致小鼠肌肉质量下降、肌纤维数目减少和肌肉功能减弱;2.高脂饮食下腓肠肌组织内及棕榈酸刺激的肌细胞内自噬相关蛋白Atg7被激活;3.腓肠肌组织及棕榈酸刺激的肌细胞内敲低Atg7能够改善高脂诱导的肌肉萎缩;4.Atg7抑制Akt磷酸化促进棕榈酸刺激下的肌蛋白降解,其作用方式可能是Atg7结合Akt抑制其磷酸化。