【摘 要】
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目的:Tau蛋白是一种基因位于常染色体17号位的微管相关性蛋白,其生理功能主要是装配和稳定微管细胞骨架。过度磷酸化的tau蛋白会自身聚集形成纤维缠结,该纤维缠结是阿尔茨海默症（AD）的一个重要病理特征。因此,靶向tau聚集是治疗AD等退行性疾病的一种有效策略。本论文基于tau蛋白聚集开展实验,旨在从tau蛋白聚集抑制剂方向筛选出一种或几种天然化合物成为潜在治疗AD的药物。方法:硫磺素-T（ThT）
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目的:Tau蛋白是一种基因位于常染色体17号位的微管相关性蛋白,其生理功能主要是装配和稳定微管细胞骨架。过度磷酸化的tau蛋白会自身聚集形成纤维缠结,该纤维缠结是阿尔茨海默症（AD）的一个重要病理特征。因此,靶向tau聚集是治疗AD等退行性疾病的一种有效策略。本论文基于tau蛋白聚集开展实验,旨在从tau蛋白聚集抑制剂方向筛选出一种或几种天然化合物成为潜在治疗AD的药物。方法:硫磺素-T（ThT）荧光检测几种天然化合物对肝素钠诱导tau K18蛋白聚集的影响,然后通过透射电子显微镜（TEM）观察化合物作用后tau K18纤维的形态;采用荧光光谱法和生物膜干涉技术（BLI）两种方法检测小分子化合物与tau K18蛋白结合力大小;用圆二色谱仪（CD）检测小分子化合物对tau K18二级结构的影响;通过紫外吸收光谱观察化合物对tau K18促微管组装的影响;进一步通过计算机虚拟分子对接技术或动力学模拟预测小分子化合物与tau K18蛋白作用机制。利用慢病毒包装技术将带有flag标签的tau441质粒转染至HEK293细胞系,用免疫印迹法（Western-blot）检测小分子化合物对细胞中tau蛋白表达水平情况;以b End.3细胞系为模板构建血脑屏障模型,检测小分子是否可以透过血脑屏障。结果:1)通过ThT实验进行药物初筛,发现只有三种黄酮醇类化合物对tau K18蛋白的聚集具有抑制效果,分别是漆黄素、槲皮素和杨梅素,这三种化合物IC50值分别为:38μM、32μM和44μM。2)进一步在tau聚集不同阶段添加漆黄素,结果表明该化合物能够抑制tau K18蛋白聚集并使tau K18原纤维解聚;通过荧光光谱实验和生物膜层干扰技术两种不同的实验方法表明,漆黄素与tau K18蛋白存在结合,并且测量结合力KD结果分别为:22.6μM和61.5μM;CD结果表明了漆黄素与tau K18结合不影响tau K18蛋白二级结构,紫外吸收光谱结果表明漆黄素不影响tau K18促进微管蛋白组装和稳定微管功能;计算机分子对接模拟佐证了漆黄素与tau K18存在结合,漆黄素酚羟基与tau K18残基His268、Val309、Lys311和Ser320主要以氢键方式结合,并能够与tau纤维核心部位的Lys331E、Lys331G以氢键方式相结合;另外,漆黄素使得HEK293-flag tau441细胞中tau蛋白表达水平提高,还可以透过血脑屏障模型。3)ThT和TEM实验结果表明槲皮素、杨梅素能够抑制tau K18蛋白聚集并使得tau纤维解聚,但二氢槲皮素、二氢杨梅素对tau K18蛋白聚集没有影响。CD结果表明这四种化合物对tau K18二级结构也没有影响,另外BLI结果表明,槲皮素、杨梅素和二氢杨梅素与tau K18蛋白存在结合。分子动力学模拟结果进一步佐证并深化了实验数据,漆黄素、槲皮素和杨梅素化合物不同程度地抑制tau肽段二聚体的形成;另外,杨梅素对tau纤维核心部分的三聚体破坏最明显。结论:1)19种天然化合物中对tau K18蛋白在体外异常聚集的抑制效果仅有3种化合物（均属于黄酮醇类）,这三种化合物抑制效果从大到小排序为:槲皮素>漆黄素>杨梅素。2)漆黄素通过以氢键的方式与tau K18结合而抑制其聚集,并可以使tau原纤维解聚;漆黄素不影响tau K18二级结构和组装微管能力,在细胞水平提高tau蛋白表达,促进tau蛋白与微管聚集;另外,漆黄素可以透过血脑屏障。3)槲皮素、杨梅素通过与tau K18蛋白结合而抑制蛋白聚集并使得纤维状蛋白解聚,尽管二氢杨梅素与tau蛋白存在结合,但是二氢槲皮素、二氢杨梅素对tau蛋白聚集过程没有影响。进一步分析发现黄酮类化合物对tau K18聚集抑制效果随着化合物亲和力的增加而增加。
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