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一、确定枯否细胞是否是肝脏清除去唾液酸化血小板的主要细胞目的血小板表面的膜蛋白大多是唾液酸化的糖蛋白,近年来研究表明血小板去唾液酸化能够引起血小板在肝脏内的异常清除,是许多病理状态下血小板减少的主要原因。但对肝脏内何种细胞清除血小板一值莫衷一是。许多研究认为肝细胞是去唾液酸化血小板清除的主要细胞类型,但2017年以来有研究显示肝窦表面枯否细胞（Kupffer cell,KC）是吞噬去唾液酸化血小板的主要细胞,但缺乏体内确凿证据。本研究旨在对去唾液酸化血小板进行体内追踪,为确定枯否细胞是清除去唾液酸化血小板的主要细胞提供体内确凿证据。方法1.建立巨核细胞/血小板特异性荧光报告（ROSAmTmG;Pf4Cre）小鼠模型。将荧光报告小鼠（ROSAmTmG小鼠,#007576,The Jackson Laboratory）与巨核细胞/血小板特异性启动子Pf4调控下表达重组酶（Cre）的转基因小鼠（Pf4Cre小鼠,#008525,The Jackson Laboratory）进行交叉繁殖,得到巨核细胞/血小板特异性表达荧光（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的报告小鼠模型（ROSA mTmG;Pf4Cre）。2.对去唾液酸化血小板进行体内追踪并且观察其与枯否细胞的共定位关系。将ROSAmTmG;Pf4Cre小鼠进行体内去唾液酸化处理以去除血小板表面膜糖蛋白上的唾液酸,或体外分离、纯化经去唾液酸化处理/对照组（Tyrode’s液处理）ROSAmTmG;Pf4Cre小鼠的枯否细胞,免疫荧光染色检测分析比较去唾液酸血小板在枯否细胞与其他肝细胞中的分布。3.用氯膦酸二钠脂质体（clodronate liposomes）去除小鼠体内枯否细胞,然后观察去唾液酸化血小板在肝脏的清除是否减少。结果1.成功构建ROSAmTmG;Pf4Cre小鼠模型。2.经体内去唾液酸化处理后的ROSAmTmG;Pf4Cre小鼠肝脏有大量EGFP（血小板）与F4/80（枯否细胞）共表达,共聚焦显微镜下三维Z stack图像清晰显示大部分EGFP阳性的血小板存在于枯否细胞内,然而对照组（Tyrode’s液处理）小鼠肝脏中几乎没有EGFP阳性血小板。此外,体外分离纯化的去唾液酸化处理组ROSAmTmG;Pf4Cre小鼠来源的枯否细胞内存在大量的EGFP阳性血小板,然而在对照组ROSAmTmG;Pf4Cre小鼠来源的枯否细胞中没有EGFP阳性血小板。我们的体内跟踪和共焦显微镜成像实验并没有检测到肝实质细胞吞噬去唾液酸化血小板的证据。3.氯膦酸二钠脂质体去除枯否细胞后,去唾液酸化血小板在小鼠肝脏的清除显著减少。结论成功建立ROSAmTmG;Pf4Cre小鼠模型,枯否细胞是肝脏清除去唾液酸化血小板的主要细胞。二、CLEC4F特异性敲除（Clec4f-/-）小鼠模型的建立及鉴定目的我们实验室既往的体外实验结果提示枯否细胞受体CLEC4F（C-type lectin domain family 4 member F 或 Kupffer cell receptor,KCR）与去唾液酸化血小板的清除有关,但对CLEC4F是否是去唾液酸化血小板在体内清除的主要受体尚无确切体内实验证据。本研究旨在建立CLEC4F特异性敲除（Clec4f/-）小鼠模型,对该小鼠模型的相关表型进行鉴定,分析CLEC4F是否是小鼠肝枯否细胞清除去唾液酸化血小板的主要受体。方法1.利用 CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）介导的基因编辑技术建立Clec4f-/-小鼠模型。具体为将靶向小鼠Clec4f基因第2号外显子的向导RNA（guide RNA,gRNA）以及金黄色葡萄球菌Cas9复合物（saCas9）mRNA共同注射至C57BL/6J纯系小鼠受精卵,将注射后的受精卵移植到CD-1假孕母鼠输卵管。出生的一 F0代雌性小鼠携带有双侧等位基因插入缺失（indel）的移码突变。将该F0代雌性小鼠与C57BL/6J纯系小鼠交配得到F1代Clec4f-/-小鼠。2.聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法鉴定 F1 代 Clec4f-/-小鼠基因型;实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）和蛋白质印迹（western blot,WB）方法分析野生型（wild type,WT）和 Clec4f-/-小鼠肝脏中 Clec4f mRNA和蛋白的表达;免疫荧光染色分析CLEC4F在WT及Clec4f-/-小鼠肝脏及脾脏等脏器中的分布情况。检测WT和Clec4f-/-小鼠体重及外周血计数。结果1.出生的一 F0代雌性小鼠携带有双侧等位基因插入缺失（indel）的移码突变。与C57BL/6J纯系小鼠交配得到二个独立的F1代CLEC4F敲除小鼠:Clec4f-/-4与Clec4f-/--6+1。与WT小鼠相比,DNA测序结果显示Clec4f-/--4小鼠Clec4f基因第2号外显子双等位基因均存在4-bp“GCGG”碱基缺失;Clec4f-/--6+1小鼠Clec4f基因第2号外显子双等位基因均存在6-bp碱基缺失及一个碱基插入。2.qRT-PCR和western blot实验证实Clec4f-/-小鼠肝脏中缺失Clec4f mRNA和蛋白的表达。免疫荧光实验结果发现WT组小鼠只有肝脏中枯否细胞共表达F4/80和CLEC4F,而Clec4f-/-小鼠肝枯否细胞仅表达F4/80,不表达CLEC4F。两组小鼠的肝实质细胞与脾脏均不表达CLEC4F。WT和Clec4f-/-两组小鼠体重无明显差异。与WT小鼠相比,Clec4f-/-小鼠外周血细胞计数包括血小板计数均正常。结论成功建立两个独立的Clec4f-/-小鼠模型,明确所建立的Clec4f-/-小鼠缺失CLEC4F,证明CLEC4F是由肝枯否细胞特异性表达。与同窝WT小鼠对比,Clec4f-/-小鼠生长发育无明显影响。WT和Clec4f-/-两组小鼠血小板数量相当,提示CLEC4F不参与调控生理状态下血小板的衰老与清除。结果显示Clec4f-/--4与Clec4f-/--6+1间无明显表型差异,故研究采用Clec4f-/--4敲除小鼠模型为主,部分重要实验结果用Clec4f-/--6+1敲除小鼠模型验证。三、阐明CLEC4F是介导小鼠肝枯否细胞吞噬去唾液酸化血小板的主要受体目的既往研究表明肝脏多种分子受体参与去唾液酸化血小板的清除。例如,去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR或Ashwell-Morell受体,AMR）已被报道介导肝实质细胞对去唾液酸化血小板的吞噬作用;枯否细胞上的巨噬细胞半乳糖凝集素（macrophage galactose lectin,MGL）也被认为对清除去唾液酸化血小板有作用。我们的前期研究提示枯否细胞CLEC4F是清除去唾液酸化血小板的主要细胞分子受体,本研究旨在探究CLEC4F是否为介导枯否细胞吞噬去唾液酸化血小板的受体及可能的相关机制。方法1.通过体外去唾液酸化处理WT小鼠来源的血小板,流式细胞术检测血小板与凝集素（RCA 1、MALII等）的结合,确定血小板去唾液酸化水平,并将去唾液酸化处理的/对照组（Tyrode’s液处理）、荧光标记的血小板输注至WT和Clec4f-/-受体小鼠,输注后不同时间点对血小板进行生存分析,观察两组小鼠肝中血小板的分布、数量以及与枯否细胞的位置关系。2.通过体内去唾液酸化处理WT和Clec4f-/-小鼠,流式细胞术检测外周血中血小板的数量以及血小板去唾液酸化水平,免疫荧光染色观察比较WT和Clec4f-/-小鼠肝中血小板的分布和数量,研究CLEC4F在介导枯否细胞吞噬去唾液酸化血小板过程中的作用。3.通过分离ROSAmTmG;Pf4Cre小鼠的EGFP阳性绿色荧光血小板并输注至WT和Clec4f-/-受体小鼠,将受体小鼠进行体内去唾液酸化处理后,观察不同时间点两组小鼠枯否细胞结合或吞噬血小板的情况,进一步研究CLEC4F介导枯否细胞识别或吞噬去唾液酸化血小板的生物学效应。4.用透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）技术为枯否细胞是清除去唾液酸化血小板的主要细胞以及CLEC4F是介导小鼠肝枯否细胞吞噬去唾液酸化血小板的主要受体提供确凿证据。5.建立缺失不同识别去唾液酸化血小板分子受体的小鼠模型,比较其对体内清除去唾液酸化血小板的不同作用。结果1.流式细胞术分析表明,与未去唾液酸化处理组血小板相比,体外去唾液酸化处理后的血小板与MALII（与α-2,3-唾液酸特异性结合的凝集素）的结合显著降低,而与RCA-1（与不含唾液酸的末端β-半乳糖特异性结合的凝集素）结合显著增加。血小板生存实验表明输注的外源性去唾液酸化WT血小板在Clec4f-/-受体小鼠中的存活率在不同的时间点均明显高于WT受体小鼠中,免疫荧光染色结果发现输注的去唾液酸化WT血小板与WT受体小鼠肝枯否细胞结合的数量明显高于Clec4f-/-受体小鼠肝枯否细胞,而输注的正常WT血小板在WT及Clec4f-/-受体小鼠肝枯否细胞数量均较少并且相当。2.体内去唾液酸化实验表明,经过去唾液酸化处理的WT及Clec4f-/-小鼠在最初的30分钟内均有显著增强的RCA-1结合率,并且持续结合至去唾液酸化处理后的24小时。WT小鼠表现出比Clec4f-/-小鼠更快的内源性血小板清除率,尤其在去唾液酸化处理后的最初的30分钟内血小板迅速减少,免疫荧光染色结果发现WT小鼠肝可见大量内源性血小板粘附在枯否细胞上,而在Clec4f-/-小鼠肝内几乎没有粘附,进一步采用z-stack高分辨率共焦成像与三维重建分析显示粘附的血小板主要被枯否细胞所吞噬,而非肝实质细胞所吞噬。3.同样,单光段高分辨率共聚焦成像与旋转三维成像显示,与体外分离的WT小鼠枯否细胞相比,体外分离的Clec4f-/-小鼠枯否细胞并不能吞噬去唾液酸化血小板。4.TEM照片明确显示WT小鼠枯否细胞结合吞噬去唾液酸化血小板,没有发现Clec4f-/-小鼠肝枯否细胞内吞噬去唾液酸化血小板。5.利用 CLEC4F 敲除（Clec4f-/-）,AMR 敲除（Asgr1-/-）,及 CLEC4F/AMR双敲除（Clec4f-/-;Asgr1-/-）小鼠模型,采用不同种细菌源性唾液酸酶对血小板进行体内及体外去唾液酸化处理,体内结果显示CLEC4F受体是介枯否细胞吞噬去唾液酸化血小板的主要分子受体。结论我们的研究表明Clec4f-/-小鼠肝枯否细胞吞噬去唾液酸化血小板能力较WT小鼠显著下降,去唾液酸化血小板主要由肝枯否细胞表面CLEC4F受体介导结合并吞噬。