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目的:建立H2O2致大鼠胰岛素瘤细胞INS-1氧化损伤的模型,并基于该氧化模型,从细胞活力、氧化应激标志物、凋亡、线粒体保护作用和胰岛素相关基因等方面,观察药对知母黄柏和主要活性成分芒果苷对INS-1细胞的保护作用,并探讨可能的相关机制,为临床用药提供理论依据。方法:1.采用体外抗氧化活性评价方法ORAC法考察不同浓度药对知母黄柏(YD:1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800、1600、3200 μg/mL)的氧自由基清除能力。2.采用25、50、100、200 μM浓度的H2O2建立INS-1细胞氧化损伤模型,MTT比色法(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法))检测细胞存活率。3.MTT法检测不同浓度药对知母黄柏(YD:1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800、1600、3200 μ g/mL)给药24 h对细胞存活率的的影响。4.基于已建立的INS-1氧化损伤模型,MTT法观察不同浓度药对知母黄柏(YD:1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200 μ g/mL)或芒果苷(MGN:50、100、500μM)预处理24 h对细胞增殖的影响。5.培养INS-1细胞,设立对照组(CON)、模型组(MOD)、阳性对照组(NAC)及不同浓度给药组,采用DCFH-DA荧光探针检测预孵育不同浓度知母黄柏(YD:50、100、200 μ g/mL)或芒果苷(MGN:50、100、500 μ M)24 h,细胞内活性氧含量变化;MDA试剂盒检测孵育不同浓度知母黄柏(YD:50、100、200μg/mL)或芒果苷(MGN:50、100、500 μM)24 h细胞脂质过氧化水平。6.流式细胞术(Flow Cytomery,FCM)检测细胞线粒体膜电位变化,RT-qPCR检测UCP2基因水平变化。7.采用Annexin V-FITC双染,流式细胞术检测预孵育知母黄柏或芒果24 h后细胞凋亡情况;采用Hoechst33342对各组细胞染色。8.RT-qPCR检测知母黄柏对Nrf2-Keap1-ARE通路激活情况及芒果苷对SOD2 mRNA表达的情况。9.RT-qPCR检测知母黄柏对INS-1细胞PDX-1 mRNA表达情况。结果:1.ORAC实验显示,知母黄柏浓度从12.5 μ g/mL分界,药物开始表现出氧自由基清除效应,且清除能力随浓度的增大迅速增强2.采用25、50、100、200 μ M H2O2刺激INS-1细胞1 h,细胞存活率分别为1.01±0.14、0.97±0.03、0.64±0.01 和 0.10±0.01。其中 100、200 μM 组与空白对照组相比具有极显著统计学差异(P<0.001)。3.知母黄柏浓度为1.65 μ g/mL至200 μ g/mL时,预处理24 h,细胞无明显毒性作用。与模型组相比,50、100及200 μ g/mL浓度对损伤细胞具有保护作用(P<0.05);50、100、500 μM MGN对损伤细胞无明显保护作用。4.活性氧实验结果显示:与CON组相比,MOD组细胞内活性氧明显上升(P<0.001);YD 50、100及200 μ g/mL对H2O2引起的活性氧具有明显的抑制作用,阳性细胞率分别为9.00±2.05%、6.93±3.03%和7.27±0.87%,与MOD组相比均具有统计学意义(P<0.01,P<0.001,P<0.001)。MGN 50、100及500 μM预处理细胞后活性氧含量明显降低,低、中、高浓度均呈不同程度降低,与MOD组相比具有统计学意义(P<0.001,P<0.05,P<0.001),阳性细胞率分别为 23.10±3.46%、26.80±2.72%、18.57±2.44%。脂质过氧化物结果显示:H2O2刺激后,模型组丙二醛含量较CON组升高,具有显著性差异(P<0.01);低、中、高浓度知母黄柏组丙二醛均呈现下降趋势,其中以YD50和YD100较MOD组具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。芒果苷低、中、高浓度组丙二醛下降程度相似,分别为1.24±0.22、1.15±0.13、1.24±0.20,且与MOD组相比均有显著统计学差异(P<0.01)。5.线粒体保护实验:(1)线粒体膜电位实验显示,MOD组线粒体膜电位较CON组显著降低(P<0.001),100及200 μ g/mL知母黄柏能够显著提高细胞膜电位,与MOD组相比具有统计学意义(P<0.001),50 μ g/mL浓度对线粒体膜电位无促进作用;芒果苷50、100 μM浓度能够提高线粒体膜电位,与MOD组相比具有统计学意义(P<0.001),500μ M浓度对线粒体膜电位无促进作用。(2)UCP2 mRNA相对表达量显示,MOD组UCP2 mRNA相对表达量较CON组降低,具有统计学差异(P<0.01),知母黄柏低、中、高剂量组均呈现不同程度的提高,其中50 μ g/mL与MOD组相比,UCP2 mRNA相对表达量具有统计学差异(P<0.01)。6.流式细胞术检测凋亡的实验显示,与CON组相比,MOD组凋亡率急剧上升(P<0.001),50、100及200 μ g/mL的知母黄柏能明显降低细胞凋亡率,分别为12.67±1.00%、11.10±0.87%、13.80±1.42%,与 MOD 组相比均具有统计学意义(P<0.001);50、100及500 μM芒果苷均能降低凋亡率,凋亡率分别为11.47±0.81%、13.70±0.14%、10.40±0.36%,与 MOD 组相比,具有统计学差异(P<0.001、P<0.05、P<0.001)。Hoechst33342染色显示,MOD组出现较多皱缩浓染细胞,知母黄柏或芒果苷预孵育后浓染细胞减少。7.Nrf2-Keap-ARE通路结果显示:对Nrf2基因:与CON组相比,MOD组Nrf2 mRNA相对表达量下降为0.76±0.07,具有统计学意义(P<0.05);知母黄柏能不同程度上调Nrf2 mRNA相对表达,低、中、高组基因表达分别为1.11±0.17、1.07±0.07和1.03±0.14,与MOD组相比,均具有统计学意义(P<0.01)。对Keap1基因:与CON组相比,MOD组Keap1 mRNA相对表达量下降为0.77±0.06,具有统计学意义(P<0.01);知母黄柏能剂量依赖性上调Keap1 mRNA相对表达,低、中、高组基因表达分别为1.14±0.11、1.20±0.13和1.36士0.14,与MOD组相比,均具有统计学意义(P<0.001)。对SOD2基因:与CON组相比,MOD组SOD2 mRNA相对表达量下降为0.83±0.15,具有统计学意义(P<0.05);知母黄柏能剂量依赖性上调SOD2 mRNA相对表达,低、中、高组基因表达分别为1.05±0.18、1.15±0.25和1.33±0.25,与MOD组相比,均具有统计学意义(P<0.05、P<0.05、P<0.001)。芒果苷50、100和500 μM剂量组,SOD2 mRNA均呈现上升趋势,相对表达量分别为1.09±0.06、1.10±0.17和1.12士0.11,与模型组相比均具有统计学意义(P<0.05、P<0.05、P<0.01)知母黄柏对NQ01基因表达量,未见明显影响。8.胰岛素相关基因PDX-1 mRNA的表达:与CON组对比,MOD组PDX-1显著下降(P<0.01),为0.50±0.03。知母黄柏低、中、高浓度组呈现浓度依赖性地上调PDX-1 mRNA,相对表达量分别为 0.76±0.14、0.94±0.27 和 1.42±0.50,其中 YD100 和 YD200与MOD相比,具有统计学意义(P<0.05,P<0.001)。结论:药对知母黄柏在体外具有一定的氧自由基清除能力,能改善H2O2引起的大鼠胰岛素瘤细胞INS-1氧化损伤,其保护机制可能与提高细胞活力、降低活性氧和脂质过氧化物含量,提高线粒体膜电位并调节UCP2基因表达,改善凋亡、激活Nrf2-Keap1-SOD2通路,并提高PDX-1基因表达有关。芒果苷对氧化损伤INS-1细胞活力并无影响,但其能降低活性氧和脂质过氧化物含量、提高线粒体膜电位并调节SOD2基因表达、降低细胞凋亡率,改善氧化应激引起的细胞损伤和凋亡。