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研究背景与目的:胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,死亡率在所有肿瘤中居第二位,其主要原因在于胃癌的复发与转移。因此阐明胃癌复发转移的具体机制,找到胃癌治疗的新靶点,为临床上制定更有效的防治策略具有重要意义。研究表明肿瘤转移与肿瘤基质和肿瘤细胞自身的特性密切相关。本研究主要从以下这两方面进行:1.肿瘤相关成纤维细胞CAFs是肿瘤微环境中主要的基质细胞,它能分泌多种细胞因子促进肿瘤生长转移。但CAFs在胃癌复发转移中的作用及其分子机制仍未完全阐明。Lumican是一种细胞外基质蛋白,在多种肿瘤中表达异常。我们前期发现胃癌CAFs表达较高水平的Lumican,本研究旨在明确Lumican在胃癌CAFs中的表达情况及与临床病理之间的联系,探讨肿瘤基质细胞来源的Lumican对胃癌细胞生物学行为的影响及其分子机制。2.组织型转谷氨酰胺酶(TG2)是TG家族成员之一,研究表明它可通过重组ECM、调节肿瘤细胞对上皮细胞的粘附以及控制肿瘤细胞的转移侵袭,参与肿瘤的发生发展。本部分旨在阐明TG2在胃癌发展中的作用以及相关分子机制。方法:1.通过q RT-PCR检测胃癌组织和癌旁正常组织,以及常见胃癌细胞株和肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)中Lumican m RNA表达水平;通过免疫荧光染色明确Lumican的细胞来源;利用免疫组织化学的方法检测Lumican蛋白的表达,并分析其与胃癌临床病理指标之间的关系。然后通过RNAi方法下调CAFs Lumican的表达水平并将其与胃癌细胞共培养,观察CAFs中Lumican下调后对胃癌细胞生物学行为的影响;通过Western blot检测FAK信号通路的改变。2.通过q RT-PCR检测胃癌组织、癌旁正常组织和胃癌细胞株中TG2m RNA表达水平;通过免疫组织化学的方法检测TG2蛋白的表达,并分析其与胃癌临床病理指标之间的关系。通过小干扰RNA和真核表达载体,分别下调和上调胃癌细胞中TG2表达水平,观察对胃癌细胞生物学行为的影响;通过Western blot检测ERK信号通路的改变。结果:1.QRT-PCR检测结果显示,胃癌组织中Lumican m RNA的相对表达量明显高于癌旁正常组织。免疫荧光染色Lumican主要表达于胃癌组织中a-SMA(+)基质细胞即CAFs中;原代培养的胃癌CAFs中Lumican的m RNA和蛋白表达量明显高于胃癌细胞株。免疫组织化学染色分析表明,Lumican蛋白在胃癌组织基质细胞中高表达,其表达水平与胃癌的浸润深度、淋巴结转移、TNM分期以及预后密切相关。通过si RNA技术下调CAFs中Lumican表达水平能有效抑制其促胃癌细胞MKN45和SGC7901的增殖、迁移和侵袭能力;相反地,用Lumican重组蛋白刺激胃癌细胞,则促进胃癌细胞MKN45和SGC7901的增殖、迁移和侵袭。Western blot检测显示,下调CAFs中Lumican能显著抑制FAK的磷酸化水平;FAK抑制后,CAFs或者Lumican重组蛋白对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的促进作用减弱。另外,下调CAFs中Lumican能明显抑制胃癌细胞integrinβ1表达水平;敲低integrinβ1之后,MKN45中FAK的磷酸化水平、细胞增殖、迁移以及侵袭能力明显下降。与体外的结果一致,下调CAFs中Lumican表达水平明显抑制胃癌细胞体内成瘤、腹腔转移能力。2.QRT-PCR检测结果显示,胃癌组织中TG2 m RNA的相对表达量明显高于癌旁正常组织。通过对117对胃癌组织和其癌旁正常组织进行免疫组织化学检测发现,TG2蛋白在胃癌组织中高表达,其表达水平与胃癌的浸润深度和TNM分期密切相关。通过si RNA技术下调胃癌细胞中TG2的表达,能有效抑制胃癌细胞MKN45和NCI-N87的增殖、迁移和侵袭;而上调TG2的表达则促进胃癌细胞SGC7901和AGS的增殖、迁移和侵袭。Western blot检测显示,下调胃癌细胞中TG2表达能显著抑制其ERK1/2磷酸化水平,而用ERK1/2抑制剂U0126处理SGC7901/TG2和AGS/TG2细胞,能明显抑制TG2过表达后所诱导的胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。另外下调胃癌细胞中TG2表达水平明显抑制胃癌细胞体内成瘤、腹腔转移能力。结论:1.Lumican在胃癌间质CAFs中的表达明显升高,其表达水平与胃癌的肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期和预后密切相关;CAFs中Lumican高表达通过激活integrinβ1-FAK信号通路,促进胃癌细胞生长、迁移和侵袭,以及裸鼠皮下瘤的生长和腹腔肿瘤结节的播散。2.TG2在胃癌中高表达,其表达水平与胃癌浸润深度、TNM分期有关;TG2能通过激活ERK1/2信号通路促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,以及体内肿瘤的生长与转移。