目前,肿瘤多药耐药(multi-drug resistance, MDR)已成为肿瘤治疗中面临的一大难题,所谓肿瘤MDR是指肿瘤接触了某些抗癌药物后产生对其他多种未接触过的、结构无关和作用机制完全不同的抗癌药物也具有交叉耐药性。肿瘤MDR产生的机制十分复杂,主要包括：细胞凋亡敏感性降低、细胞存活信号通路的异常活化、药物外排泵ABC转运蛋白(P-glycoprotein, P-gp等)过表达、药物作用靶点的改变、DNA损伤修复活性增强、药物解毒与消除酶活性增强或过表达等。肿瘤MDR逆转剂是通过抑制转运蛋白的功能或表达,恢复耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。与此不同,抗耐药药物则是通过直接杀伤或抑制耐药肿瘤克服肿瘤MDR。近年来,抗耐药研究越来越受到人们的重视。我国天然产物资源丰富,从天然产物及其衍生物中寻找新型抗耐药化合物或肿瘤MDR逆转剂具有广阔的前景。在此,我们发现汉防己甲素新型衍生物H1在体内、外均显示出良好的抗耐药作用,而且在无毒浓度时能显著逆转P-gp所介导的肿瘤MDR,并对其分子机制进行了初步探讨。本论文主要分为两部分：第一部分,H1抗耐药药效学评价及其分子机制研究；第二部分,无毒浓度H1逆转P-gp介导的肿瘤MDR作用及对P-gp表达与功能的影响。第一部分H1抗耐药药效学评价及其分子机制研究本部分实验主要研究了汉防己甲素新型衍生物H1体内、外抗耐药作用及其对敏感株、耐药株细胞凋亡通路与存活信号通路的影响。采用MTT比色法测定H1对8株不同组织来源肿瘤细胞的细胞毒活性,再以KB、KBv200; MCF-7、MCF-7/adr;A549、A549/tax亲本与其相应的耐药细胞为研究对象,以三种常用的抗肿瘤药物阿霉素(ADR)、紫杉醇(TAX)、长春新碱(VCR)为对照,系统评价了H1体外抗耐药作用。建立敏感性KB、耐药性KBv200裸鼠移植瘤模型,以VCR为阳性对照药,结合KB裸鼠移植瘤模型考察KBv200裸鼠移植瘤模型的体内耐药性,进而采用KB、KBv200裸鼠移植瘤模型评价H1低、中、高(10、15、20mg/kg)三个剂量的抗肿瘤效果,评价H1体内抗耐药作用。PI单染法流式细胞仪检测H1对敏感株细胞KB、耐药株细胞KBv200细胞周期的影响。采用DAPI染色法观察细胞形态学变化；琼脂糖凝胶电泳分析细胞DNA片段化状态；PI-AnnexinV双染法定量检测H1诱导KB、KBv200细胞凋亡作用。JC-1染色法检测H1对KB、KBv200细胞线粒体膜电位的影响。H1处理KB、KBv200细胞24h后,Western blot方法检测内源性凋亡通路相关蛋白：Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3的表达及线粒体膜间隙蛋白细胞色素-C、AIF的释放；外源性凋亡通路相关蛋白：Fas、FasL、Caspase-8的表达；以及细胞存活性信号通路PI3K-AKT、MEK-ERK中关键分子p-ERK、ERK、p-AKT、AKT的表达。与此同时,以Bel7042/5-Fu细胞为研究对象,以5-Fu为对照,评价了Bel7042/5-Fu细胞的耐药特性及H1对Bel7402/5-Fu与Be17402细胞的生长抑制作用。采用Trizol法提取了Bel7402、Bel7402/5-Fu细胞及H1(4μM)处理细胞24h后的mRNA,以琼脂糖凝胶电泳进行RNA质量检测。采用Affimatrix基因表达芯片平台分析敏感株细胞Be17402,耐药株细胞Bel7402/5-Fu,以及H1处理后Bel7402、Bel7402/5-Fu细胞全基因组表达水平变化。研究结果显示：H1对8株不同组织来源的肿瘤细胞都具有不同程度的生长抑制作用,IC50在1-4μM之间,对KB、Bel7402的生长抑制作用较为显著,1C50分别为1.068±0.017、0.671±0.026(μM)。体外抗耐药作用研究显示H1不仅对敏感株细胞具有较好的杀伤作用,而且对耐药株细胞也同样具有显著的抑制作用,平均耐药因子(resistant factor, RF)仅为1.6,而三种抗肿瘤药物’TAX、ADR、VCR的平均耐药因子分别为：22.6、71.7、52.3。可见,在体外H1具有良好的抗耐药作用。KB、KBv200裸鼠移植瘤实验表明：在敏感性KB裸鼠模型,VCR给药组的相对肿瘤体积抑制百分率、瘤重抑制百分率分别为：84.4%、82.1%,显示出良好的抗肿瘤效果。但在耐药肿瘤模型(KBv200裸鼠移植瘤模型)VCR给药组的相对肿瘤体积抑制百分率、瘤重抑制百分率则分别为：12.6、27.7%,KBv200细胞在体内仍然对VCR展现良好的耐药作用,证明建立的体内耐药移植瘤模型是成功的。H1无论在敏感性KB裸鼠移植瘤还是在耐药性KBv200裸鼠移植瘤模型都具有显著的抗肿瘤效果,并且显示良好的剂量依赖关系。尤其是H1高剂量组(即20mg/kg)对敏感株KB裸鼠移植瘤的相对肿瘤体积与重量抑制百分率分别为79.7%、79.0%；对耐药株KBv200裸鼠移植瘤的相对肿瘤体积与重量抑制百分率分别为61.5%、74.9%。可见,H1在我们建立的体内移植瘤耐药模型中仍具有良好的抗耐药作用。作用机制显示：H1对KB、KBv200细胞周期分布无显著影响,但我们观察到随着H1浓度的增加出现凋亡峰(Sub-G1)。DPAI染色显示细胞核皱缩、碎裂、染色加深,且凋亡细胞的百分率随着H1浓度的升高而增加。琼脂糖凝胶电泳检测到典型的DNA片段化(DNALadder)现象。PI-AnnexinV染色后发现H1诱导KB细胞的凋亡作用略强于耐药株细胞KBv200,8μM Hl处理组诱导KB细胞晚期凋亡百分率为85.4%,而诱导耐药细胞KBv200细胞晚期凋亡的百分率为42.4%,这一结果与细胞增殖抑制活性结果相一致。无论在敏感细胞KB还是在耐药细胞KBv200,H1均能升高Bax/Bcl-2比例、降低线粒体膜电位、使细胞色素-C、AIF从线粒体释放到胞浆,进而活化Caspase-3,启动内源性凋亡通路；但H1对Fas、FasL、Caspase-8的表达无影响,提示H1诱导KB、KBv200细胞凋亡不依赖于外源性凋亡通路。KB细胞对Hl的凋亡敏感性略强于耐药细胞KBv200。同时,H1能显著抑制ERK、AKT的磷酸化水平,下调PI3K-AKT、MEK-ERK信号通路,这可能与Hl的抗耐药作用相关。另一方面,Bel7402/5-Fu细胞对5-Fu具有明显的耐药性,耐药因子为161.1,而H1的耐药因子仅为6.0,H1在Bel7402/5-Fu细胞显示出一定的抗耐药作用。基因表达芯片结果显示Bel7402/5-Fu细胞与亲本细胞Be17402相比,发生主要变化的基因为有非受体酪氨酸激酶FYN(上调),p38MAPK(上调),凋亡效应激酶Caspase-3基因(下调)。JAK-STAT通路相关基因表达上调,AKT基因上调,抗凋亡作用增强。H1处理后Bel7402/5-Fu细胞与亲本细胞Be17402相比,发生主要变化的有Fas/FasL介导的外源性凋亡相关基因(下调)。非受体酪氨酸激酶FYN(上调),PI3K-AKT通路相关基因(上调)。上述结果表明：无论在体外还是体内,H1均显示出良好的抗耐药作用。其分子机制可能与启动内源性凋亡通路、下调细胞存活通路PI3k-AKT、MEK-ERK等有大。第二部分无毒浓度H1逆转P-gp介导的肿瘤MDR作用及对P-gp表达与功能的影响本部分实验主要研究了无毒浓度H1对P-gp介导肿瘤MDR的逆转作用并检测其对P-gp表达与功能的影响。采用MTT比色法测定H1对KB、MCF-7与其相应的P-gp过表达耐药株KBv200、MCF-7/adr细胞的生长曲线,以维拉帕米(VRP)为阳性对照药,选择无毒浓度H1(0.125、0.25、0.5μM)与3种抗肿瘤药物VCR、ADR、TAX合用评价其逆转肿瘤MDR作用,并计算逆转倍数(reversal fold, RF)。流式细胞仪测定H1处理后KBv200细胞P-gp对其底物阿霉素、罗丹明123的蓄积与外排功能的影响。Pgp-GloTM试剂盒检测H1对VRP刺激的重组P-gpATPase活性的影响。计算机辅助设计Discovery.Studio分子模拟软件对H1的空间结构与P-gp三维构象进行了分子对接模拟,考察H1分子与P-gp结合能力。Western blot方法检测无毒浓度H1处理KBv200细胞48h后P-gp表达水平,RT-PCR检测MDR1转录水平的变化。引入放线菌酮(CHX)考察0.5μM H1处理后对P-gp半衰期的影响。免疫沉淀法(Immunoprecipitation,IP)检测H1对P-gp泛素化水平的影响。同时考察H1对KBv200细胞MAPK信号通路的影响以及RNAi沉默ERK1与ERK2基因或ERK特异性抑制剂U0126、PD98059对P-gp表达水平的影响。研究结果显示：H1能够有效逆转P-gp介导肿瘤MDR并具有良好的剂量依赖关系。0.5μM H1能够完全逆转KBv200细胞对VCR、ADR、TAX的耐药作用,逆转倍数分别为54.0、28.4、50.1。同时H1对P-gp介导MCF-7/adr的MDR也具有良好的逆转作用,0.5μM H1完全逆转MCF-7/adr细胞对ADR的耐药作用,部分逆转MCF-7/adr细胞对VCR、TAX的耐药作用,逆转倍数分别为126.8、24.8、10.1。无毒浓度H1可以显著干扰P-gp的转运功能,蓄积与外排功能实验表明H1可以浓度依赖性增加ADR、罗丹明123的蓄积,并能剂量依赖性的抑制P-gp介导的罗丹明123外排功能。同时,H1能明显抑制维拉帕米(VRP)刺激的重组P-gp的ATPase活性。H1的空间结构与P-gp三维构象分子对接模拟结果显示H1与P-gp的ATP口袋之间存在氢键、疏水性相互作用,结合能力较强,计算机评分达到141分。0.5μM H1处理KBv200细胞48h后可以显著降低P-gp表达,并呈剂量依赖关系,但RT-PCR结果显示H1并不影响P-gp的(?)nRNA水平。进一步研究显示0.5μM H1与CHX (100mg/mL)合用后与单独CHX组相比,H1能够使P-gp的半衰期由18.3h减少至13.5h,0.5μM H1处理KBv200细胞48h后可显著增加P-gp的泛素化水平,促进P-gp的降解。无毒浓度H1对JNK、p38MAPK的活化无显著影响,但能明显下调MEK-ERK信号通路,并具有良好的剂量依赖关系。RNAi沉默ERK1与ERK2基因或采用U0126、PD98059处理KBv200细胞后,均检测到P-gp表达下调,表明MEK-ERK信号通路参与了P-gp的表达调控。上述结果提示：无毒浓度H1具有良好的逆转肿瘤MDR作用,不仅能干扰P-gp的转运功能,而且影响P-gp的稳定性,下调P-gp蛋白表达。综上所述,新型汉防己甲素衍生物H1在体内、外均具有良好的抗耐药作用,其分子机制可能与启动内源性凋亡通路、抑制细胞存活通路PI3K-AKT、MEK-ERK有关。此外,无毒浓度H1能逆转P-gp介导的肿瘤MDR,不仅能干扰P-gp的转运功能,而且影响P-gp的稳定性,下调P-gp蛋白表达。提示H1对临床MDR肿瘤的治疗可能有一定潜能。