第一部分 葡萄糖在调控肠道炎症中的作用及机制研究研究背景及目的:炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）是发生于消化道的一种慢性炎症性疾病,临床上根据其症状及病理学表现可进一步分为克罗恩病（Crohn’s disease,CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）等亚型。据不完全统计,全球超过500万人患有UC或CD,尤其以北美和欧洲最为严重,而作为“低风险区”的亚洲地区（如中国,日本,韩国等）,近年来IBD的发病率显著升高。该疾病旷日持久和迁延不愈的性质给患者带来了沉重的经济和精神负担。既往的研究表明,IBD的发生发展受到环境因素、菌群变化、各种遗传易感特性和免疫系统变化之间复杂的相互作用的影响。随着近年来对IBD相关研究的不断深入,越来越多的证据表明饮食因素可能在IBD的病因和病程中发挥重要的作用。糖类物质作为机体最主要的能量来源,一方面有利于维护机体组织和细胞的结构与功能,另一方面长期大量的糖类物质摄入可引起机体免疫代谢紊乱,内环境失调,诱发多种自身免疫性疾病,如糖尿病,IBD,肥胖症等病情发生。近年来更是将糖类物质的过量摄入视为诱发IBD发病的重要危险因素之一,既往研究表明葡萄糖在调节幼稚T细胞分化中发挥重要作用,然而适宜剂量的葡萄糖摄入对T细胞的功能以及肠道炎症的影响仍知之甚少。因此本课题拟深入研究葡萄糖摄入对机体T细胞功能的影响以及其在肠道炎症中的作用。研究方法:1.建立幼稚T细胞输注炎症模型,实验组分别给予含有6%和20%葡萄糖的饮水,对照组给予正常饮水连续7周,7周后处死小鼠,分别从小鼠脾脏（spleen）和肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph node,MLN）提取T细胞,并通过流式细胞术（Flow cytometry,FACS）分析各T细胞亚群的比例变化,同时取小鼠结肠组织制作病理切片,经苏木素-伊红染色（H&E染色）后,在镜下评估肠道炎症程度。2.体外分离CBir1老鼠脾脏幼稚T细胞,辅以Cbir1抗原肽以及经X线照射后的抗原提呈细胞（Antigen-presenting cell,APC）协同刺激活化后,并在不同的T细胞分化条件下,以不同浓度（500ug/m1,2500ug/ml,7000ug/ml）的葡萄糖刺激细胞,5天后通过FACS分析各分化条件下,相应T细胞亚群的比例变化。3.利用野生型老鼠或建立幼稚T细胞转输模型模拟老鼠生理条件,实验组给予含有6%葡萄糖的饮水,对照组给予正常饮水2周,2周后处死小鼠,分别提取并利用FACS分析小鼠脾脏和MLN各T细胞亚群的比例变化。研究结果:1.与对照组相比,实验组予以6%葡萄糖饮水的小鼠肠道炎症显著减轻,而予以20%葡萄糖饮水的小鼠肠道炎症明显加重。FACS结果显示,相较于对照组,6%葡萄糖水处理组小鼠MLN中Treg细胞比例显著升高,其他T细胞亚群比例无差异,20%葡萄糖水处理组小鼠MLN中Th17细胞比例显著升高,其他T细胞亚群比例无显著差异,各组老鼠脾脏T细胞亚群比例皆无显著性差异。2.体外培养的T细胞中,葡萄糖特异性的促进Treg细胞的分化,并呈现剂量依赖性,而其他T细胞亚型的分化无影响。3.与对照组相比,6%糖水处理组小鼠MLN中Treg细胞比例显著升高,其他T细胞亚群无显著差异。研究结论:1.不同浓度的葡萄糖可差异性的调节肠道炎症,该差异可能由于葡萄糖对调节/效应T细胞平衡的调控。2.适当浓度的葡萄糖摄入后在体内体外皆可促进Treg细胞的分化。第二部分葡萄糖诱导调节性T细胞分化在维持肠道免疫稳态的作用及机制研究研究背景及目的:众所周知,CD4+T细胞在调控肠粘膜免疫中发挥重要作用。近年来的研究表明IBD中的炎症与调节型T细胞（Regulatory T cells,Treg）和促炎性Th17在体内的失衡密切相关,提示肠黏膜免疫系统的异常在IBD疾病进展及预后中起着至关重要的作用。调节型T细胞（Treg）是一群特殊的CD4+T细胞,其可通过抑制其他效应T细胞的增殖来调控肠道免疫,因此也被视为肠道免疫调节剂,并在免疫耐受和维持机体免疫稳态中发挥重要作用。诸多研究表明,外周幼稚T细胞可通过感知外界抗原刺激,活化并诱导Treg细胞分化,因此,富含丰富的共生菌群和饮食抗原的肠道被视为是Treg细胞在外周分化的主要部位。然而,菌群及饮食抗原调控肠道Treg分化的相关机制尚未完全揭露。近年来的研究发现,芳香烃受体（Ahr）可感知多种菌群和饮食抗原信号,并在调节Treg细胞分化及功能上发挥重要的作用。为此,我们推测葡萄糖可能通过Ahr信号通路调控肠道Treg细胞分化,进而调节肠道免疫稳态。研究方法:1.体外分离并在Treg分化条件下培养幼稚T细胞,对照组予以常规培养基刺激,实验组予以7000ug/ml葡萄糖刺激,5天后收取细胞,分别与经CFSE标记后的CD45.1+幼稚T细胞共培养60小时（共培养比例1:1）,并用流式细胞术（Flow cytometry,FACS）分析葡萄糖诱导的Treg对T细胞增殖的影响。2.建立CD45RBhi T细胞转输炎症模型:体外分离并在Treg分化条件下培养幼稚T细胞,对照组予以常规培养基刺激,实验组予以700ug/ml葡萄糖刺激,5天后收取细胞,并分别与经流式细胞分析仪分选出的CD45.1+CD45RBhiT细胞按一定比例混合后输注至Rag-/-小鼠体内。4周后处死小鼠,通过FACS分析小鼠肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph node,MLN）和固有层（Lamina propria,LP）中 CD45.1+CD4+T细胞比例变化,同时收取小鼠结肠组织制作病理切片,经苏木素-伊红染色（H&E染色）后,在镜下评估肠道炎症程度。3.体外分离并在Treg分化条件下培养幼稚T细胞,对照组与实验组分别予以常规培养基或7000ug/ml葡萄糖刺激2天,并用qPCR检测刺激2天后Cyp1a1和Cyp1a2的表达。4.体外分离并在Treg分化条件下培养幼稚T细胞,对照组予以常规培养基刺激,实验组分别予以葡萄糖或在同等浓度葡萄糖的基础上予以Ahr抑制剂刺激,5天后收取细胞,并用FACS分析各组Treg细胞的比例变化。5.分离Ahr敲除老鼠脾脏幼稚T细胞,并建立幼稚T细胞转输模型模拟老鼠生理条件,实验组给予含有6%葡萄糖的饮水,对照组给予正常饮水2周,2周后处死小鼠,分别提取并利用FACS分析小鼠脾脏和MLN各T细胞亚群的比例变化。研究结果:1.与对照组相比,葡萄糖诱导的Treg细胞对T细胞增殖的抑制能力显著增强。2.与对照组相比,输注了葡萄糖诱导的Treg细胞后,小鼠肠道炎症显著减轻,MLN和LP中CD45.1+T细胞比例明显降低。3.与对照组相比,葡萄糖刺激2天后,Cyplal和Cyp1a2的表达显著升高。4.与对照组相比,葡萄糖在体外促进Treg细胞分化,Ahr抑制剂处理抑制了葡萄糖诱导的Treg细胞分化。5.Ahr敲除老鼠幼稚T细胞输注两周后,两组老鼠脾脏和MLN中各T细胞亚群比例皆无明显差异。研究结论:1.葡萄糖体内体外都促进了 Treg细胞对效应T细胞增殖的抑制能力。2.葡萄糖促进了 T细胞内Ahr的激活。3.葡萄糖通过调控Ahr信号通路促进Treg细胞的分化。第三部分葡萄糖代谢产物L-乳酸在调控肠道炎症中的作用及相关机制研究研究背景及目的:炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）作为一种肠道特发性炎症性疾病,其发病机制尚不清楚,近年来的研究认为IBD的发病机制可能与机体影响肠道稳态有关的一种或多种因素异常相关。肠屏障作为关键因素之一,一方面完整的肠上皮屏障可保护宿主免受外部环境的侵害,同时锁定肠腔中的有害微生物和毒素,防止它们侵入肠道。另一方面它们可通过将抗原直接加工并呈递给肠道免疫系统的细胞,从而发挥非专业抗原提呈细胞的作用。肠屏障是肠上皮细胞（intestinal epithelia1 cell,IEC）构成的负责系统,通常情况下,上皮细胞可通过自身增殖、分化和迁移等方式维持上皮屏障的完整性,肠上皮屏障的破坏和损伤导致宿主直接暴露于病原体环境中,从而引发炎症和肠稳态失调。近年来的研究表明肠道微环境的改变与肠屏障功能和完整性的维持密切相关,有报道称菌群代谢产物在调控上皮修复中发挥重要作用,然而,作为影响肠道微环境的另一重要因素,宿主代谢产物对肠上皮的调控作用尚未完全揭示,因此本研究旨在探讨宿主细胞主要的代谢产物L-乳酸钠对宿主肠上皮细胞迁移功能的影响以及其在肠道炎症中的作用。研究方法:1.通过细胞划痕愈合实验,对照组予以常规培养基处理,实验组予以5mML-乳酸钠处理,观察L-乳酸钠对小鼠肠上皮细胞系（Mode-K）迁移的影响,同时基于划痕实验的基础上进行细胞追踪,并利用软件分析L-乳酸钠对上皮细胞迁移持续性和速度的影响。2.使用5mML-乳酸钠处理Mode-K细胞12小时后,使用PCR检测迁移相关基因Cdc42和Pak1的表达。3.体外培养Mode-K细胞,对照组和实验组分别予以常规培养基或5mM L-乳酸钠刺激4小时,并使用Seahorse分析L-乳酸对上皮细胞代谢功能的影响。4.通过细胞划痕实验,并根据Seahorse结果,选择性的使用代谢抑制剂,观察该抑制剂对L-乳酸钠诱导的肠上皮细胞系迁移的影响。5.建立DSS炎症模型,对照组予以正常饮水,实验组予以包含30mM L-乳酸钠的饮水10天,期间追踪两组间体重变化,10天后处死小鼠,提取小鼠结肠上皮细胞,并利用qPCR分析迁移相关基因Cdc42、Pak1的表达,同时收取小鼠结肠组织制作病理切片,经苏木素-伊红染色（H&E染色）后,在镜下评估肠道炎症程度。研究结果:1.细胞划痕结果显示L-乳酸钠促进了划痕愈合,细胞追踪结果显示L-乳酸钠促进小鼠肠上皮细胞迁移速度和持久性。2.与对照组相比,处理组细胞Cdc42的表达,而Pakl表达无显著性差异。3.Seahorse结果显示L-乳酸钠刺激4小时后,处理组氧耗率（OCR）升高,基础氧耗率和线粒体ATP生成量显著升高,两组胞外酸化率（ECAR）无明显差异。4.基于Seahorse结果使用线粒体ATP合成酶抑制剂oligomycin,划痕结果显示,抑制剂处理组,oligomycin抑制了 L-乳酸钠诱导的肠上皮细胞迁移,细胞追踪结果显示,与单纯L-乳酸钠处理组相比,抑制剂组同时抑制了上皮细胞迁移速度和持久性。5.与对照组相比,30mM L-乳酸钠处理组小鼠肠道炎症显著减轻,结肠IEC迁移相关基因Cdc42,Pak1表达升高。研究结论:1.L-乳酸钠促进小鼠肠上皮细胞线粒体功能。2.L-乳酸钠通过促进小鼠肠上皮细胞线粒体ATP合成提升上皮细胞迁移的速度和持久性,进而促进上皮细胞迁移。3.L-乳酸钠治疗能显著升高小鼠结肠IEC迁移相关基因Cdc42,Pak1表达,促进上皮细胞迁移,从而缓解肠道炎症。