【摘 要】
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目的:探究Wip1基因敲除后对肿瘤进展的影响作用并阐明其调控机制。方法:1、处于对数生长期的小鼠Lewis肺癌细胞（LLC细胞）经皮下接种到Wip1基因敲除小鼠和野生型小鼠体内,造模四周后取出肿瘤组织,比较两组小鼠成瘤大小;免疫组化检测肿瘤组织的侵袭、迁移能力。2、分离出WT和Wip1-/-肿瘤组织中的肿瘤细胞,体外成球实验验证自我更新能力;qPCR检测干性相关基因的表达情况。3、分离出WT和Wi
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目的:探究Wip1基因敲除后对肿瘤进展的影响作用并阐明其调控机制。方法:1、处于对数生长期的小鼠Lewis肺癌细胞（LLC细胞）经皮下接种到Wip1基因敲除小鼠和野生型小鼠体内,造模四周后取出肿瘤组织,比较两组小鼠成瘤大小;免疫组化检测肿瘤组织的侵袭、迁移能力。2、分离出WT和Wip1-/-肿瘤组织中的肿瘤细胞,体外成球实验验证自我更新能力;qPCR检测干性相关基因的表达情况。3、分离出WT和Wip1-/-肿瘤组织中的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）,qPCR检测WT TAM和Wip1-/-TAM中的促炎性细胞因子如iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-α等和抑炎性细胞因子如ARG1、TGF-β、MRC-1等的表达情况;流式细胞术（FCM）检测两组TAM的增殖、凋亡水平;体外成球实验验证自我更新能力;qPCR及Western Blot方法检测干性相关因子的表达变化。4、用电镜观察WT TAM和Wip1-/-TAM的线粒体的数量和形态;用相应试剂盒检测WT TAM和Wip1-/-TAM中的mtDNA、ATP、乳酸含量;FCM检测线粒体活性氧含量,以及功能受损线粒体的数量;Seahorse检测WT TAM和Wip1-/-TAM中OCR和ECAR的表达水平;qPCR检测两组TAM中呼吸链复合物和糖酵解相关基因的表达情况。结果:1、Wip1基因敲除后,肿瘤的发展受到明显的抑制,侵袭、迁移能力减弱。2、Wip1-/-的肿瘤细胞自我更新能力减弱,干性相关基因的表达水平降低。3、Wip1-/-TAM高表达促炎性细胞因子而低表达抑炎性细胞因子;Wip1-/-TAM增殖减少,细胞凋亡增加,自我更新能力减弱,干性相关基因的表达水平降低。4、Wip1-/-TAM中的线粒体数量明显减少,线粒体肿胀,脊减少、消失,基质变空;mtDNA、ATP和ROS含量减少,乳酸含量增多,线粒体损伤增加,呼吸链复合物表达明显降低,糖酵解相关基因的表达上调。结论:Wip1促进线粒体的氧化磷酸化途径,增强巨噬细胞的自我更新能力,诱导TAM向抑炎型巨噬细胞极化,进而促进肿瘤的发展。
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