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研究目的肝癌的高转移特性是影响肝癌治疗效果的重要因素之一,肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)在肝癌的发生发展、复发转移和耐药过程中起着关键作用。课题组前期研究发现高表达溶酶体相关4次跨膜蛋白B(lysosome-associated protein transmembrane 4 beta,LAPTM4B)的肝癌细胞具有较强的侵袭转移能力,推测LAPTM4B可能参与维持肝癌细胞干性而调控肝癌的恶性转化。本课题利用免疫磁性细胞分选法分选肝癌干细胞,旨在研究LAPTM4B对肝癌干细胞干性维持的影响,初步探讨LAPTM4B调控肝癌细胞干性的分子机制,为肝癌的预后判断及放化疗联合治疗提供理论基础。研究方法1利用CD133免疫磁性细胞分选法分别从人肝癌细胞系(Huh7、HepG2)中分选CD133~+的肝癌干细胞,根据流式细胞术和Western Blot法对分选前后CD133~+细胞所占的比例进行对比分析。并使用CCK-8试剂盒以CD133~-细胞组为对照检测CD133~+HepG2及CD133~+Huh7肝癌干细胞的增殖能力水平。运用平板克隆形成实验检测CD133~+HepG2及CD133~+Huh7肝癌干细胞克隆形成能力。在条件培养基中培养并观察CD133~+HepG2及CD133~+Huh7肝癌干细胞单克隆细胞球团的形成能力。qPCR及Western Blot检测CD133~+HepG2及CD133~+Huh7肝癌干细胞中相关干性基因的表达情况。2针对LAPTM4B基因设计并构建shRNA质粒表达载体,对其序列进行测序,将正确构建的表达载体与辅助载体VSVG、RRE、REV质粒共转染293FT细胞,包装并生产慢病毒载体LV-shLAPTM4B。3使用慢病毒感染CD133~+HepG2及CD133~+Huh7肝癌干细胞,筛选出稳定干扰LAPTM4B表达的CD133~+HepG2及CD133~+Huh7肝癌干细胞株,通过Western Blot及qPCR方法检测其干扰效率及相关干性基因的表达情况变化,并采用克隆形成、悬浮成球实验检测LAPTM4B对CD133~+肝癌干细胞干性维持的影响。研究结果1利用免疫磁性细胞分选法分选得出CD133~+HepG2和CD133~+Huh7细胞,其纯度分别为93.27%±3.02%和95.80%±2.19%。CD133~+细胞在条件培养基中培养呈球团样生长,而CD133~-细胞则无此现象。CCK-8增殖实验、克隆形成实验结果显示CD133~+细胞较CD133~-细胞的增殖及克隆形成能力显著增强。且相关干性基因EpCAM、SOX9、OCT4、Nanog等的表达也显著上调,说明分选所得CD133~+细胞具有较强肝癌干细胞相关干性特征。2根据DNA测序的鉴定结果,携带特异性沉默LAPTM4B基因shRNA片段的质粒构建正确,成功包装生产慢病毒并感染CD133~+HepG2及CD133~+Huh7细胞,筛选出的稳转细胞株敲减效率分别为89.74%±2.20%和69.70%±1.64%,LAPTM4B蛋白在干扰组细胞中表达显著低于空载对照组。3克隆形成实验显示感染LV-shLAPTM4B的CD133~+HepG2及CD133~+Huh7肝癌干细胞较LV-ctrl组的克隆形成能力明显减弱。悬浮成球实验显示感染LV-shLAPTM4B的CD133~+HepG2及CD133~+Huh7细胞成球能力较LV-ctrl组明显减弱。Western Blot及qPCR结果显示感染LV-shLAPTM4B的CD133~+HepG2及CD133~+Huh7细胞相关干性基因表达较LV-ctrl组下调。结论1利用免疫磁性细胞分选法成功分选CD133~+HepG2和CD133~+Huh7肝癌干细胞,纯度较高,且具有肿瘤干细胞相关特性。2应用慢病毒载体成功构建LAPTM4B基因表达敲减的CD133~+HepG2及CD133~+Huh7稳转细胞株。3通过体外实验证实敲低LAPTM4B可导致CD133~+肝癌干细胞的干性能力减弱,干性因子表达显著下调,表明LAPTM4B对肝癌干细胞的干性具有重要的调节作用。