【摘 要】
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目的:构建体外培养的人皮肤组织并观察糖尿病溃疡患者血清对组织血管生成的影响方法:1、人包皮组织的培养:收集临床包皮环切术后皮肤组织,碘伏消毒,无菌PBS漂洗后固定于不锈钢支架上,分为两组,一组令真皮侧与培养基接触进行培养,表皮侧处于气相保持干燥,即气液交界组（G-L）;另一组完全浸没于培养基培养,即浸没组（Im）。使用两种不同浓度的胎牛血清培养基进行培养（10%胎牛血清和5%胎牛血清）,并观察其状
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目的:构建体外培养的人皮肤组织并观察糖尿病溃疡患者血清对组织血管生成的影响方法:1、人包皮组织的培养:收集临床包皮环切术后皮肤组织,碘伏消毒,无菌PBS漂洗后固定于不锈钢支架上,分为两组,一组令真皮侧与培养基接触进行培养,表皮侧处于气相保持干燥,即气液交界组（G-L）;另一组完全浸没于培养基培养,即浸没组（Im）。使用两种不同浓度的胎牛血清培养基进行培养（10%胎牛血清和5%胎牛血清）,并观察其状态。2、人包皮组织的组织形态学观察:制备石蜡切片行常规HE染色并观察组织（G-L组和Im组）形态。3、糖尿病溃疡患者血清对人包皮组织血管形成的影响:石蜡切片免疫组化并观察组织（糖尿病溃疡血清DFU组和健康对照HC组）血管数量。4、糖尿病溃疡患者血清对人包皮组织相关细胞因子的影响:提取组织总RNA,采用实时定量PCR技术分析VEGF-192,TNF-α,TGF-β,IL-6,IL-1β基因m RNA表达情况。结果:1、使用10%胎牛血清培养基培养的组织与使用5%胎牛血清培养基培养的组织无显著差异,培养时间可达4周左右,因此后续实验均采用5%胎牛血清培养组织。2、Im（浸没）组与G-L（气液交界）组在同一时间相比,G-L（气液交界）组表皮结构相对更清晰完整,表皮结构维持时间更长久;两组的真皮层结构变化差异不明显。3、镜下观察DFU组（糖尿病溃疡组）血管破坏程度较HC组（健康对照组）更严重。此外,血管累计数量与健康对照组相比,糖尿病溃疡组3,7,10天血管数量减少较为明显。4、提取组织总RNA,采用实定量PCR技术分析VEGF-192,TNF-α,TGF-β,IL-6,IL-1β基因m RNA表达情况:实时荧光定量PCR检测分析发现糖尿病溃疡患者血清能够下调VEGF基因表达水平,同时上调TGF-β,IL-6和IL-1β基因表达水平。结论:人体皮肤组织体外培养体系的构建是可行的,培养时间可达4周左右。使用10%胎牛血清培养基培养的组织与使用5%胎牛血清培养基培养的组织无显著差异;4周内2组组织能够存活,2周内存活较好,1周时间内组织状态最好,且G-L组组织状态较Im组更好;糖尿病溃疡患者血清能够使人包皮组织血管生成减少,同时,糖尿病溃疡患者血清下调VEGF基因表达水平,上调TGF-β,IL-6和IL-1β基因m RNA表达水平。
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