论文部分内容阅读
研究背景:铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是战创伤感染、院内获得性感染最常见的病原菌之一。为应对PA感染高发和高度耐药的问题,在研发新型抗生素的同时,研发PA疫苗亦迫在眉睫。迄今为止虽有多个PA疫苗进入了临床试验阶段,但仍没有PA疫苗获批上市。综合分析,现阶段PA疫苗主要依赖血清特异性抗体发挥保护效果,而无法在感染入侵的第一线发挥作用。此外,PA基因组的高度多样性也可能是现阶段疫苗研发失败的原因。因此高效诱导广谱的粘膜保护应答是成功研制PA疫苗的关键。疫苗诱导的Th17（T helper cell 17）应答在抵抗肺部病原体感染的过程中发挥关键作用。Th17应答不依赖血清特异性抗体,而主要通过募集中性粒细胞和巨噬细胞等途径发挥广谱保护效果。组织驻留记忆T细胞（Tissue resident memory T cell,TRM）长期存在于非淋巴器官,在局部粘膜组织（如皮肤、呼吸道等）发挥免疫监察和快速应对病原体感染的作用。PA感染后细胞因子IL-17A显著升高,抗体中和IL-17A后PA感染症状显著加重。减毒PA疫苗能够通过诱导Th17应答发挥抵御多种血清型PA感染的保护作用。因此我们推测鉴定可诱导粘膜Th17应答的保护性抗原,将是成功研制PA疫苗的关键。研究目的:1.基于重组PA蛋白抗原库筛选高效诱导肺部Th17应答的保护性抗原。2.明确保护性抗原中诱导Th17应答的优势表位,并以此为基础设计和构建亚单位疫苗,并研究其保护效果和机制。3.探索TRM细胞在PA疫苗介导的免疫保护中的作用及其机制。研究方法:1.制备10个纯度高、稳定性好的可溶PA抗原并经滴鼻免疫小鼠,利用流式细胞术检测肺部Th17（CD3+CD4+IL-17A+）细胞的比例和数量,评价候选抗原诱导肺部Th17应答水平的能力;采用致死剂量PA攻毒免疫后小鼠,评价候选抗原的保护效果。2.通过抗原特异性CD4+T细胞过继实验、IL-17A KO小鼠及IL-17A中和实验明确新抗原re Pcr V和re Amp C的免疫保护效果与Th17应答的关系。3.将抗原re Pcr V分别滴鼻免疫和肌注免疫小鼠,攻毒后从生存率、肺组织病理改变、细菌定植以及促炎细胞因子浓度方面比较两种免疫方式的保护效果;检测免疫后血清中anti-re Pcr V抗体效价及其OPK活性;利用流式细胞术检测肺部re Pcr V特异性Th17比例和数量。4.利用ELISpots鉴定re Pcr V和re Amp C中诱导Th17应答的优势表位,再构建并制备双亚单位抗原PVAC;将PVAC滴鼻免疫小鼠,检测其抗体效价和肺部Th17应答水平;用四株不同血清型PA临床菌株评价PVAC的广谱保护效果。5.将re Pcr V滴鼻免疫小鼠,利用流式细胞术、免疫荧光检测小鼠肺部IL-17A+CD4+TRM(CD44highCD4+CD69+CD62L-IL-17A+)的数量和比例;利用FTY720清除循环淋巴细胞后,攻毒后观察小鼠生存率、感染症状等指标变化,评价IL-17A+CD4+TRM的保护效果;亚致死剂量PA攻毒免疫后小鼠,检测感染后IL-17A+CD4+TRM比例及数量变化,抗体中和IL-17A和IFN-γ实验研究IL-17A+CD4+TRM的保护机制。研究结果:第一部分:铜绿假单胞菌诱导Th17应答的保护性抗原筛选1.诱导Th17应答水平排名前三的抗原是re Opr L、re Amp C和re Pcr V,其免疫后小鼠生存率分别为50%、50%和100%,其余候选抗原组小鼠生存率与对照组比均无显著差异。re Amp C和re Pcr V为本研究首次发现可诱导Th17应答的保护性抗原。2.Re Pcr V滴鼻免疫组（I.n）小鼠生存率显著高于肌注免疫组（I.m）。与I.m组相比,I.n组肺部炎症较轻、细菌定植量和促炎细胞因子水平较低,表明re Pcr V滴鼻免疫保护效果优于肌注免疫。虽然I.n组血清anti-re Pcr V Ig G效价显著低于I.m组,但两种免疫血清的OPK活性无显著差异;I.n组诱导肺部re Pcr V特异性Th17细胞的比例及数量显著高于I.m组。第二部分:re Pcr V和re Amp C保护效果依赖于Th17应答1.过继re Pcr V或re Amp C滴鼻免疫小鼠来源的CD4+T细胞给naive小鼠,攻毒后发现其肺部细菌定植量、肺部炎症改变和炎症因子水平显著低于对照组;经re Pcr V或re Amp C免疫的IL-17A KO小鼠,攻毒后生存率分别为30%和10%,显著低于野生型小鼠;经re Pcr V或re Amp C免疫小鼠使用抗体中和IL-17A后,攻毒后的生存率分别降低至30%和0%,显著低于对照组。2.Re Amp C滴鼻免疫小鼠的血清特异性抗体无显著OPK活性。第三部分:诱导Th17应答的表位筛选及融合疫苗构建和保护效果评价1.Re Pcr V中诱导Th17应答的优势表位分别为Pcr V8-25、Pcr V29-46、Pcr V43-60、Pcr V57-74、Pcr V64-81、Pcr V78-95、Pcr V92-109、Pcr V106-123、Pcr V197-214、Pcr V218-235;Re Amp C中诱导Th17应答的优势表位为Amp C64-81、Amp C78-95、Amp C99-116、Amp C155-172、Amp C169-186、Amp C183-200、Amp C204-221、Amp C281-298。2.成功构建并在大肠杆菌中表达多表位融合疫苗抗原PVAC（取re Pcr V N端[27Glu-126Gly]用GSGGSG Linker连接至re Amp C全长）,经纯化后获得纯度为87.6%的PVAC蛋白;PVAC免疫后血清抗体效价及肺部Th17应答水平均显著高于未免疫组;PVAC免疫小鼠后分别使用致死剂量的临床菌株PA 464、PA XN-1、PA ZNJ004和PA 451（血清型分别为F、I、J和A型）攻毒,小鼠生存率分别为70%、60%、100%和50%,均显著高于未免疫组。第四部分:TRM在re Pcr V滴鼻免疫增强保护的作用机制研究1.Re Pcr V滴鼻免疫后肺CD4+IL-17A+TRM细胞的比例显著高于未免疫组,但CD4+IFN-γ+TRM细胞的比例无显著变化;免疫荧光结果显示,re Pcr V免疫组小鼠肺CD69+IL-17A+细胞较未免疫组明显增多;RT-PCR结果表明,re Pcr V免疫后肺CD4+T细胞Hobit、Blimp-1和RORγt的m RNA水平显著高于未免疫组,而T-bet的m RNA水平与未免疫组相比无显著差异。2.FTY720耗竭循环淋巴细胞后致死剂量PA攻毒小鼠,结果显示re Pcr V免疫组小鼠生存率为50%,显著高于未免疫组;亚致死剂量攻毒后免疫组小鼠的疾病评分、体重变化、肺部细菌定植量及炎症病理评分均显著低于未免疫组;re Pcr V免疫组小鼠肺部CD4+IL-17A+TRM细胞的比例显著高于未免疫组,免疫荧光观察发现re Pcr V滴鼻免疫组小鼠肺部CD69+IL-17A+细胞相较未免疫组明显增多;抗体中和IL-17A后re Pcr V免疫组小鼠生存率为0%,显著低于非特异性抗体处理组,而抗体中和IFN-γ后re Pcr V免疫组小鼠生存率无显著变化。研究结论及意义:1.首次发现滴鼻免疫re Pcr V和re Amp C能够诱导小鼠肺部保护性Th17应答。2.与肌注免疫相比,re Pcr V滴鼻免疫可增强免疫保护效果,与其诱导的肺部Th17应答相关。3.鉴定出re Pcr V和re Amp C中诱导Th17应答的优势表位,以此为基础成功构建并制备双亚单位融合抗原PVAC,并证明其可抵御四种不同血清型PA菌株的肺部感染。4.Re Pcr V滴鼻免疫可诱导小鼠肺部IL-17A+CD4+TRM细胞产生并在抗PA感染中发挥作用。5.PVAC在一定程度上解决了传统PA疫苗很难诱导粘膜应答和基因组高度变异的难题,为下一步成功研发PA疫苗打下坚实的基础,也为及其它呼吸道感染病原体疫苗的研发提供了思路。