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神经炎症是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的一个重要病理特征。小胶质细胞和星形胶质细胞的渐进激活以及促炎因子的过度产生,是造成β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptide,Aβ）沉积、神经元损伤的一个重要原因,因此抑制炎症反应可能是一条有效的AD治疗途径。G蛋白偶联雌激素受体（G-protein coupled estrogen receptor,GPER）是一种七次跨膜G蛋白偶联受体,可介导雌激素快速的非基因组效应,在啮齿动物CNS多个区域均有广泛表达,其中海马及大脑皮层表达量较高。有文献报道在多发性硬化症及大鼠脑缺血模型中,GPER介导了雌激素的抗炎作用,虽然雌激素的神经保护作用已被证实,但雌激素替代治疗的副作用,限制了其临床应用,从传统中药中筛选具有类雌激素样的活性成分是医药界研究的热点。淫羊藿苷（icariin,ICA）是淫羊藿提取物淫羊藿总黄酮的主要活性成分,淫羊藿素（icaritin,ICT）是淫羊藿苷的水解衍生物,二者均属于植物雌激素,并具有抗肿瘤、抗炎和神经保护等多种药理活性。本课题组前期研究表明,淫羊藿苷和巫山淫羊藿素能够抑制脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的ICR小鼠的炎症反应,其抗炎保护作用可以被GPER特异性阻断剂G15所阻断,但GPER是否能与淫羊藿苷和巫山淫羊藿素直接结合,GPER是否可作为AD的治疗和新药筛选的潜在靶点,需要进一步探讨。目的:1.应用分子对接技术,明确GPER是否是淫羊藿苷、巫山淫羊藿素的直接结合靶点;2.应用GPER+/+（野生型）和GPER-/-（基因敲除）C57BL/6J小鼠,探讨GPER基因敲除对淫羊藿苷、巫山淫羊藿素抗AD炎症反应的影响。方法:1.利用GPCR-I-TASSER等在线服务器进行GPER建模,应用分子对接技术分析淫羊藿苷及巫山淫羊藿素与GPER的靶向结合能力。2.应用由CRISPR-Cas9技术构建的GPER基因敲除小鼠,检测GPER基因缺失对小鼠表型的影响。3.侧脑室立体定位注射LPS,制备GPER+/+和GPER-/-AD炎症小鼠模型,连续12天灌胃给予淫羊藿苷（10 mg/kg）和巫山淫羊藿素（10 mg/kg）。4.水迷宫实验检测小鼠的空间学习记忆能力。5.应用real time PCR技术检测海马白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,i NOS）和环氧化酶（cyclooxygenase,COX-2）的基因表达。6.应用western blot技术检测i NOS、COX-2、离子钙接头蛋白分子1（ionized calcium binding adaptor molecule 1,Iba1）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）的蛋白表达。结果:1.应用GPER 3D模型,模拟检测淫羊藿苷、巫山淫羊藿素与GPER的结合能力。结果显示淫羊藿苷和巫山淫羊藿素与GPER的结合能分别为-6.3 kcal/mol和-9.3kcal/mol,巫山淫羊藿素与GPER的结合能力优于淫羊藿苷,接近GPER特异性激动剂G1的结合能（-9.8 kcal/mol）。2.体重测量结果显示,3月龄雄性GPER-/-小鼠的体重显著高于GPER+/+小鼠（P<0.001）。Real time PCR结果显示,GPER-/-小鼠较GPER+/+小鼠显著上调海马区促炎因子i NOS和COX-2的基因表达（P<0.05,P<0.01）;TNF-α、IL-1β的基因表达有上调的趋势,但无统计学意义。提示GPER基因敲除,增加了小鼠海马区的炎症反应。3.水迷宫实验结果显示,对照组GPER+/+小鼠和GPER-/-小鼠相比,行为学无明显差异。与对照组相比,GPER+/+和GPER-/-小鼠LPS模型组的轨迹均无规律,潜伏期均明显延长,目的象限时间比及平台穿越次数亦显著降低（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。与LPS模型组相比,淫羊藿苷（10 mg/kg）和巫山淫羊藿素（10 mg/kg）给药处理后,GPER+/+小鼠趋向于平台所在象限,小鼠定位能力增强,显著改善了LPS诱导的GPER+/+小鼠空间学习记忆障碍（P<0.01,P<0.001）,巫山淫羊藿素的改善作用有略强于淫羊藿苷的趋势。在GPER-/-小鼠中,给予淫羊藿苷和巫山淫羊藿素灌胃给药,其对LPS诱导的小鼠空间学习记忆障碍没有明显的改善作用,提示GPER基因敲除后,显著降低了淫羊藿苷和巫山淫羊藿素对学习记忆能力的改善作用。4.Real time PCR结果显示,与对照组相比,LPS显著诱导了GPER+/+小鼠促炎因子IL-1β、TNF-α、i NOS、COX-2的基因表达（P<0.001）,也显著上调了GPER-/-小鼠海马区促炎因子IL-1β、TNF-α的基因表达（P<0.05,P<0.01）,而i NOS、COX-2的基因表达有上调的趋势,但无统计学意义。与LPS模型组相比,淫羊藿苷和巫山淫羊藿素显著降低了GPER+/+小鼠海马区促炎因子的基因表达（P<0.05,P<0.01,P<0.001）,在GPER-/-小鼠中,淫羊藿苷、巫山淫羊藿素对LPS诱导的海马炎症反应的抑制作用明显减弱,与LPS组相比,无统计学意义。5.Western blot结果显示,LPS模型组与对照组相比,GPER+/+及GPER-/-小鼠海马区促炎酶i NOS、COX-2的蛋白表达显著增加（P<0.01,P<0.001）。与LPS模型组相比,淫羊藿苷、巫山淫羊藿素显著抑制了GPER+/+小鼠海马区促炎酶的蛋白表达（P<0.01,P<0.001）,GPER基因敲除后,淫羊藿苷、巫山淫羊藿素对i NOS、COX-2的蛋白表达的抑制作用明显减弱,与LPS组相比,无统计学意义。6.为检测本实验模型中小胶质细胞和星形胶质细胞的活化情况,我们运用western blot技术检测海马Iba1和GFAP的蛋白表达情况。结果显示,与对照组相比,LPS显著上调GPER+/+及GPER-/-小鼠海马区Iba1和GFAP的蛋白表达（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。相比于LPS模型组,淫羊藿苷和巫山淫羊藿素给药后显著抑制了GPER+/+小鼠海马区Iba1和GFAP的蛋白表达（P<0.05）,但GPER-/-小鼠上述蛋白的表达有降低的趋势,差异无统计学意义。结论:分子对接结果表明淫羊藿苷和巫山淫羊藿素能够与GPER靶向结合,巫山淫羊藿素与GPER的的结合能力强于淫羊藿苷。GPER基因敲除可导致雄性小鼠肥胖,促进海马炎症反应,显著降低淫羊藿苷和巫山淫羊藿素抗AD炎症反应的作用,提示GPER可能是淫羊藿苷和巫山淫羊藿素抗AD炎症反应的直接作用靶点。