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研究背景和目的:宫颈癌是严重影响女性生命健康的疾病。研究发现,micro RNA-21（miR-21）在He La细胞（人宫颈癌细胞）中高表达,并有研究推测miR-21基因邻近人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）整合位点处可能与其在宫颈癌中表达水平升高有关。因此检测He La细胞中的miR-21具有重要意义。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）与宫颈癌的发生发展及预后关系密切,是治疗宫颈癌的一个重要靶点。将si RNA作为基因治疗的工具,开发高效的si RNA载送系统尤为重要。本文基于DNA自组装技术实现了对He La细胞miR-21的等温免酶信号放大检测和活细胞内原位成像分析,以及原位生成VEGF si RNA用于宫颈癌的基因治疗,为宫颈癌的治疗提供了新的研究方向。方法:设计的免酶DNA circuit包含三种DNA发夹（H1,H2/PS和H3）,由miR-21引发催化发夹组装反应,实现靶循环信号放大并自组装得到“DNA纳米轮”结构,从而实现对miR-21的高灵敏度、高特异性检测。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）及原子力显微镜（Atomic force microscope,AFM）对反应产物进行表征,验证实验方案的可行性;通过荧光动力学实验和荧光光谱表征反应体系中miR-21浓度与荧光强度之间的关系以及该方法的特异性。此外,通过激光共聚焦（Confocal laser scanning microscopy imaging,CLSM）实验表征miR-21在细胞内的表达和分布情况。将VEGF的正义序列和反义序列设计到发夹结构中,DNA发夹转染进入He La细胞后,细胞内过表达的miR-21引发催化发夹组装反应,生成含有大量VEGF si RNA的“DNA纳米轮”结构,在Dicer酶切作用下,VEGF si RNA特异性抑制细胞内相关基因的表达。通过实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR,q RT-PCR）、蛋白质印记法（Western blot,WB）验证基因沉默效果;利用流式细胞术及细胞增殖实验（Cell Counting Kit-8,CCK-8）验证原位生成的VEGF si RNA对He La细胞的杀伤作用。最后,通过构建宫颈癌He La细胞裸鼠皮下移植瘤,研究免酶DNA circuit的活体治疗效果。结果:（1）PAGE表征显示miR-21成功引发DNA发夹自组装并生成大分子量的DNA结构;AFM表征显示,DNA发夹混合物中加入miR-21后生成了单分散球形的“DNA纳米轮”结构,均验证了miR-21引发免酶DNA circuit自组装反应发生的可行性。荧光动力学及荧光光谱表征显示免酶DNA电路的运行随miR-21浓度增加荧光强度增强。共聚焦实验结果表明,转染DNA发夹混合物（DNA circuit）的He La细胞有较强的荧光信号,非特异性DNA circuit（NR-circuit）组及anti-miR-21预处理的He La细胞观察不到荧光恢复,表明miR-21催化免酶DNA circuit的特异性。将该方法用于多种活细胞内（Hep G2细胞和L-02细胞）miR-21的原位成像分析,结果显示在miR-21高表达的Hep G2细胞中观察到荧光恢复,而在miR-21低表达的L-02细胞中未观察到荧光恢复,进一步证明该免酶DNA circuit的通用性。（2）q RT-PCR及WB结果显示miR-21引发免酶DNA circuit自组装原位生成VEGF si RNA具有良好的基因沉默效果,与Naked si RNA组（VEGF m RNA和VEGF蛋白表达抑制率分别为29.22%和41.89%）相比,DNA circuit对VEGF m RNA及VEGF蛋白表达的抑制率分别为48.94%和64.46%,表明其高效的基因沉默效率。细胞凋亡实验表明,与Naked si RNA组（30.30%）相比,原位生成的VEGF si RNA诱导细胞凋亡率增加（42.40%）,表明DNA circuit能够保护si RNA,使其更好的发挥基因治疗的作用。CCK-8实验结果显示DNA circuit组细胞活性最低（32.86%）。异种移植瘤实验结果显示,DNA circuit明显抑制肿瘤的生长,且经苏木精-伊红（hematoxylin eosin,H&E）染色结果显示各组均无器官毒性,表明所设计的体系具有良好的生物相容性。结论:（1）本研究所构建的免酶DNA电路实现了等温信号放大检测miR-21及活细胞内miR-21的原位成像分析,具有灵敏度高、特异性好等优点。（2）所构建的免酶DNA催化体系能够保护VEGF si RNA在复杂的肿瘤微环境中不发生降解,具有良好的生物稳定性。（3）通过原位生成VEGF si RNA,显示出增强的基因沉默效应和肿瘤细胞杀伤作用。将所建立的体系应用于宫颈癌异种移植瘤模型,有效抑制了宫颈癌细胞的生长,为DNA纳米技术的应用提供了新的研究方向。