不明部位妊娠妊（pregnancy of unknown location,PUL）和不明活性妊娠（pregnancy of uncertain viability,OUV）阶段引起了医生们的广泛关注,因为有部分的流产和异位妊娠隐藏其中。因此,提早预测早孕不良结局在妇产科中具有重要的意义,提高不良妊娠的检出率,有助于尽早地干预,同时降低异位妊娠导致的并发症和死亡率。一般情况下,血清β-hCG倍增的速度快慢、孕酮的水平高低以及超声检查都是目前常用的判断早期不良妊娠的方法。但现有的预测方法存在一定的局限性:一方面预测的敏感性和特异性还不够理想,另一方面,等待的时间比较久,期间需要反复抽血随访和动态的超声检查,这些都增加了花费和焦虑的情绪,同时等待过程可能出现严重的并发症。β-hCG不仅可以在孕妇血清中检测到,而且可以在尿液和宫颈分泌物中检测到。既往的研究表明,在孕妇的宫颈分泌物和血清中,β-hCG浓度的比值对早期妊娠流产的评估有重要意义。然而,由于宫颈分泌物中β-hCG含量较低,准确检测其含量是一个巨大的挑战。在众多的生物检测方法中,基于稀土螯合物的时间分辨荧光免疫分析法已被用作敏感的生物检测方法,尤其是β-hCG的检测。而稀土掺杂无机纳米发光材料更是因为其纳米材料尺寸以及形貌的变化,使得发光性质和激发态动力学如光吸收、荧光寿命、能量传递、发光量子产率和浓度猝灭等表现出比稀土螯合物更优异的性能。生物体或者生物组织采用紫外激发光照射时,会导致产生自荧光现象。时间分辨光致发光技术可以区分稀土的长寿命发光（从μs到ms量级）和生物自荧光和散射光产生的短寿命背景噪声（ns量级）。因此根据稀土离子荧光寿命较长的特点,结合时间分辨检测技术,设置合理的延迟时间和门控时间,可以有效地消除自荧光和背景荧光的干扰,提高检测的灵敏度和信噪。本文提出了一种利用Li LuF₄:Ce/Tb纳米颗粒作为时间分辨光致发光（time-resolved photoluminescence,TRPL）纳米探针的异相夹心生物测定β-hCG的独特方法。与传统的稳态荧光相比,它在生物测定中可以显著提高检测的灵敏度,从而使β-hCG检测试剂盒比市售的β-hCG检测试剂盒更为灵敏。通过该方法对β-hCG的检测,明显提高了检测的敏感度和特异性,并通过检测宫颈分泌物和血液中β-hCG浓度,将二者的比值作为一个指标,可以预测不明着床位置和胚胎活性阶段的不良妊娠结局,有望缩短不良妊娠判断的时间窗,减少因反复抽血检查和等待超声明确而带来的花费和焦虑情绪,为临床提前干预提供依据,避免了因延迟诊断而导致的严重并发症。本文主要的研究方法与结果如下:1.Li LuF₄纳米颗粒的制备、结构形貌表征和发光性能测试（1）采用高温热分解的方法制备稀土掺杂Li Lu F₄纳米发光材料;（2）XRD衍射图样可知,所有的衍射峰都能很好地符合Li LuF₄四方相结构（JCPDS No.027-1251,空间群I41/a）,没有其它杂相出现;（3）透射电子显微镜图像观察制备的Li Lu F₄纳米材料为菱形的晶体,形貌粒径均一且分散性良好;高分辨透射电子显微镜观测晶格条纹,面间距为0.46nm,证实与四方Li LuF₄（101）面的点阵间距一致;（4）根据TEM观察结果,选择200个纳米颗粒粒径计算平均值;（5）Li LuF₄的选区电子衍射（SAED）图:Li LuF4:5%Ce/5%Tb纳米颗粒结晶度高,物相是四方相,与XRD结果一致。（6）EDS分析图可以确定纳米晶中含有Lu、F、Ce、Tb四种元素,证明最终产物是四方相Li LuF₄:Ce/Tb纳米晶。7)LiLu F₄:5%Ce/5%Tb纳米发光材料的光学性能测试,在其最强激发峰296 nm的激发下,Li Lu F₄:Ce/Tb纳米材料的下转移发射光主要集中在绿光区域。8)选择性地监测⁵D₄→⁷F₅（544.2 nm）的跃迁,得到了Tb³⁺离子⁵D₄能级的荧光衰减曲线。通过单指数方程拟合⁵D₄→⁷F₅能级的荧光衰减曲线,可以得到⁵D₄能级的荧光寿命分别为4.69ms。9)对下转移量子产率的测试结果为67.6±0.8%。2.Li LuF₄:Ce/Tb纳米颗粒表面修饰和发光性能测试（1）采用酸洗处理的方法,将Li LuF₄:Ce/Tb纳米颗粒表面包覆的油酸（OA）分子去除,使纳米颗粒表面带正电荷的Ln³⁺离子裸露出来;（2）透射电子显微镜观察酸洗后的纳米颗粒形貌情况和分散性;（3）傅里叶红外光谱（FT-IR）四个分别在1551、1452、2923和2857 cm^-1处达到峰值（归属于油酸覆盖的纳米粒子的峰）,在去除油酸配体后消失;而在生物素化的纳米粒子中,清晰地观察到以1646 cm^-1为中心的强酰胺带,证实酸洗处理的方法成功的将油酸分子从Li Lu F4纳米颗粒的表面去除并完成生物素化;（4）热重分析（TGA）的测试结果:油酸配体包覆的LiLuF₄:Ce/Tb纳米颗粒在温度达到并超过340℃后失重4.7%,生物素修饰的Li LuF₄:Ce/Tb纳米颗粒与未修饰的Li LuF4:Ce/Tb纳米颗粒对比发现,温度升到250℃左右时,纳米颗粒失重分别为1.5%和1.0%,证实油酸分子从LiLu F₄纳米颗粒的表面去除和纳米颗粒生物素化;（5）水合粒径测定酸洗后纳米颗粒的水合粒径为24.4nm,而生物素化后的纳米颗粒水合粒径为68.2 nm,酸洗后Li LuF₄:Ce/Tb纳米颗粒的Zeta电势测试结果为33.9 mV。生物素分子偶联在纳米晶表面后,纳米晶水溶液的Zeta电势由变为+13.7 mV。这些都证明无配体化的纳米颗粒与生物素的羧基基团之间较强的配位能力,在纳米颗粒表面成功地偶联上生物素分子;（6）比较表面修饰前后Li LuF₄:Ce/Tb纳米材料发光性能的变化。与油酸配体包覆的Li LuF₄:Ce/Tb纳米颗粒相比,无油酸配体和生物素化的LiLuF₄:Ce/Tb纳米颗粒的综合光致发光强度分别提高了3.4倍和1.7倍。Tb³⁺的光致发光寿命从油酸配体包裹的Li LuF₄:Ce/Tb纳米颗粒的4.69 ms增加到无油酸配体的LiLu F₄:Ce/Tb纳米颗粒的6.71 ms,再到生物素修饰的Li LuF₄:Ce/Tb纳米颗粒的7.49 ms,增加了2.8ms。3.基于稀土掺杂LiLu F₄下转移发光纳米探针异相时间分辨免疫荧光法对β-hCG的应用检测（1）基于LiLuF₄:Ce/Tb纳米探针的异相时间分辨免疫荧光分析法检测β-hCG数值,绘制标准曲线和校准曲线,校准曲线表明,随着β-hCG浓度的增加,纳米探针的发光强度逐渐增大,在0-8 ng·ml^-1范围内与β-hCG浓度呈线性关系。检测限（LOD）定义为浓度相当于在对照组中测量的信号标准偏差的三倍,被确定为6.1 pg·ml^-1。;（2）利用其他可能干扰生物分子和电解质（包括碳水化合物、蛋白质和金属离子）进行干扰性研究,在其他相同条件下,由于缺乏特异性结合,TRPL信号几乎不可检测,表明该检测方法的高度特异性;（3）血清和宫颈分泌物的CVs分别低于9%和10%,回收率分别在91-108%和93%-103%之间。符合生物测定方法验证的可接受标准,证实了Li LuF₄:Ce/Tb-TRPL纳米探针用于血清和宫颈β-hCG检测的检测精密度和回收率。4.基于LiLuF₄:Ce,Tb纳米探针时间分辨免疫荧光法测定宫颈分泌物和血清β-hCG的比值及其对妊娠不良结局判断（1）纳入42例研究对象,采集临床信息,收集检测样本,按要求进行随访直至明确妊娠结局,按不同结局进行分组（宫内妊娠存活28例,宫内妊娠流产6例,宫外异位妊娠8例）;（2）人宫颈分泌物与血清中β-hCG的比值、人血清中β-hCG 48小时增长速度以及孕酮的数值在早孕期不同妊娠结局方面均有显著性差异;在宫内组中,宫颈分泌物中的β-hCG水平比血清中的β-hCG水平低约3-5个数量级,而在宫内妊娠流产组和异位妊娠组中,数值仅比血清中的β-hCG水平低1-2个数量级,甚至有的更高。与宫内妊娠存活组相比,宫内妊娠流产和宫外异位妊娠组中的β-hCG（宫颈分泌物/血清）比值均升高了2-3个数量级。这些观察表明,宫颈分泌物和血清中β-hCG水平的比值可以作为未知部位早期妊娠胚胎生存能力的有效指标;（3）从ROC曲线来看,不同指标在不同妊娠结局的预测方面有所差异,但β-hCG（宫颈分泌物/血清）比值较其他三个指标的曲线下面积大,说明该指标的预测的价值更高。（4）从散点图来看,宫颈分泌物和血清中β-hCG水平的比值高于0.003会提示宫外妊娠或宫内妊娠流产的可能,而低于0.003提示为正常的宫内妊娠。宫颈液和血清中的hCG比率高于0.01可能是区分宫外妊娠和宫内妊娠流产的一个指标。（5）从不良妊娠结局的回顾来看,最早出现β-hCG（宫颈分泌物/血清）比值异常的是在停经33天,这提示该数值作为预测指标有可能缩短窗口期1-2周时间。本研究的结论主要可归纳为:1.本文采用的稀土纳米探针具有优异的发光性能,具有高的发光量子产率和长的荧光寿命。2.通过与生物素的结合,其可以作为一种高效的时间分辨光致发光的纳米探针,通过时间分辨异相三明治式生物测定痕量的β-hCG抗原,最低检测限为6.1 pg·ml^-1,比商品化的试剂盒降低了三个数量级。3.利用新型的Li Lu F₄:Ce/Tb时间分辨荧光纳米探针,检测处于妊娠部位不明和妊娠结局不明阶段的早孕妇女β-hCG（宫颈分泌物/血清）比值,可作为不明部位早期妊娠孕妇妊娠结局预判的良好指标。4.该方法不需要反复的抽血检查,有望缩短不良妊娠判断的时间窗,为临床提前干预提供依据,避免了因延迟诊断而导致的严重并发症。综上所述,本研究的发现给围产期医学带来了新的机遇。采用新型高效的稀土时间分辨纳米荧光探针可以检测不同体液中β-hCG浓度,这可以作为临床应用的新方法。我们的研究结果也为未来多功能生物医学应用的发光纳米探针的发展奠定了基础。