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桔梗[Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.]为桔梗科桔梗属多年生草本植物,该属全世界仅1种1变种,广布于我国东部温带至亚热带的湿润半湿润地区,是我国大宗常用中药材,也是典型的药食同源植物。桔梗以其干燥根入药,具有宣肺、散寒、祛痰、消肿、镇咳、排脓等功效。表征其药材质量的主要药效成分为桔梗皂苷类成分,其中桔梗皂苷D含量是《中华人民共和国药典》规定的质量标准成分。药材质量的形成与控制研究是其生产技术创新的重要基础。水是植物光合作用的基础物质,也是植物各种生理代谢过程的重要介质和参与者,在农业生产中水分调控也是提高作物产量和质量的重要农艺措施,因此,研究水因子对药材产量和质量形成的影响,特别是干旱逆境对药材质量的影响具有重要意义。有关水及其调控对桔梗药材产量和质量影响的研究较少,其对干旱胁迫的生理与分子生态响应的研究尚属空白,为此,我们采用盆栽试验,模拟自然环境,对同一种源、相同年限桔梗进行水分调控,通过对不同生长时期(营养期、花期和果期)的桔梗进行干旱胁迫,分析研究了桔梗的光合生理、抗逆生理、皂苷含量及其生物合成基因表达等变化对干旱胁迫的响应,通过转录组学分析揭示其对干旱响应的分子机制(基因调控网络),阐释桔梗皂苷合成对干旱逆境响应的分子生态过程,旨在为桔梗药材生产实施水分生态调控提供科学依据。主要研究结论如下:(1)不同生长时期干旱胁迫下,桔梗初生代谢产物(12种氨基酸和8种核苷类成分)对水分信号响应机制不同。DS(干旱胁迫最重)阶段,营养期(6种)和果期(11种)桔梗的初生代谢产物受负面影响较大;花期桔梗仅4种核苷类成分受到负面影响。AT(秋季)阶段,营养期桔梗中仅ALA含量显著提高;花期和果期桔梗分别有7种和4种初生代谢产物积累显著增加。另外,DS阶段,营养期和花期桔梗中ALA、次黄嘌呤、别嘌醇含量显著降低,而果期桔梗中ALA、次黄嘌呤、别嘌醇却分别提高了28.04%、31.09%、22.39%。总体来说,当干旱发生时,由于桔梗所处的生育状况不同,初生代谢产物对水分响应方式存在差异,从直接影响(DS)和长期影响(AT)来看,干旱胁迫对营养期和果期桔梗初生代谢产物的积累多为负面,而对花期桔梗则多为正向促进。同时,对于干旱胁迫,同一生长时期桔梗的氨基酸或核苷类成分的生物合成调控表现出促进和抑制相互转换的双重性分子生态响应策略。(2)干旱胁迫对果期桔梗的调控更有利于桔梗药材质量的提高。DS阶段,营养期、花期、果期桔梗PD3、DPD积累具有一致性,均显著高于CK(p<0.05)。桔梗可能通过次生代谢产物的积累来积极以抵御短期干旱逆境。AT阶段,营养期桔梗仅PD3和SPD含量提高,花期桔梗皂苷(PD、PD3、DPD、SPD)均未显著积累,而果期桔梗三种单体皂苷(PD、PD3、DPD)和桔梗总皂苷(SPD)含量分别提高了8.95%、11.67%、12.54%、21.67%。次黄嘌呤是影响营养期桔梗皂苷PD、PD3的生物合成的重要初生代谢产物;多种氨基酸及核苷对花期桔梗中PD的积累有显著的促进作用;鸟嘌呤、ALA对果期桔梗皂苷的积累有显著的促进作用,而VAL对果期桔梗皂苷积累多为负面的,说明果期桔梗中鸟嘌呤、ALA和VAL是影响其桔梗皂苷积累的重要因素,是调控果期桔梗质量的重要初生代谢产物。从干旱胁迫长期影响(AT阶段)来看,与营养期和花期相比,干旱胁迫诱导果期桔梗中桔梗皂苷类成分大量合成,是把控桔梗药材质量的关键时期。(3)不同生长时期桔梗的光合生理、抗性生理、次生代谢对干旱胁迫响应机制研究表明:DS阶段,三个生长时期桔梗因体内积累大量的活性氧,使其光合生理特性减弱,桔梗通过提高保护酶T-SOD、POD和CAT活性的方式抵御干旱带来的细胞氧化伤害。DS阶段,花期桔梗SS、PRO含量分别为CK的2.37倍和1.53倍,其SP含量显著降低,营养期桔梗PRO、SP均没有显著增加,而果期SP、PRO显著增加。不同生长时期干旱胁迫下,桔梗不同生理应激指标间相互促进和制约,对干旱胁迫做出协同反应,维持桔梗体内生理平衡,但不同生长时期桔梗对干旱胁迫响应并不一致,揭示桔梗适应逆境生理变化的复杂性。营养期桔梗中PD、PD3与T-SOD,DPD与CAT、POD,SPD与SS显著正相关(p<0.05);花期桔梗DPD和PD3与根干重、PRO、φPSII显著正相关(p<0.05);果期桔梗PD与SS、φPSⅡ显著正相关(p<0.05),PD、PD3与CAT和WUE均极显著正相关。揭示桔梗皂苷的合成与光合作用、叶绿素荧光、渗透调节物质和保护酶之间存在相关性。(4)不同生长时期桔梗皂苷生物合成关键酶对水分调控响应过程分析表明:受干旱胁迫影响,三个生长时期DS阶段上调基因数目的差异(8个、6个、3个)是不同生长时期桔梗对水分的区别响应,也是影响此阶段桔梗皂苷合成差异的主要因素。岭回归分析显示,营养期桔梗HMGR、IPPI、MVD、PMK、SS、β-A28O的显著上调,花期桔梗HMGR、UGT1的显著上调,果期桔梗PMK的显著上调,是各时期桔梗皂苷在DS阶段积累的重要影响因素。同时β-A28O和β-AS在AT阶段的显著上调是果期桔梗皂苷在秋季显著积累的主要关键酶基因。(5)果期桔梗不同阶段(F_DS、F_RW、F_AT)转录组分析表明:分别在F_DS、F_RW、F_AT中差异表达基因(DEGs)有2087、1453、1447个,说明大部分DEGs是在F_DS阶段被诱导表达的。萜类骨架和三萜类化合物合成途径中有5个DGEs(TRINITY_DN21285_c0_g9、TRINITY_DN22095_c1_g3、TRINITY_DN24750_c0_g3、TRINITY_DN22394_c1_g10、TRINITY_DN27385_c1_g4)仅在F_DS阶段表达模式发生变化,这些基因可能是果期桔梗皂苷合成途径中参与干旱胁迫应答的重要调控基因。干旱胁迫对果期桔梗NAC转录因子中Group1和Group 3基因有明显抑制作用,而对Group 4基因有明显诱导作用;对C3H转录因子中Group1和Group 3基因有明显抑制作用。推测和NAC C3H转录因子可能与果期桔梗抵御干旱逆境密切相关。