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胶体金免疫层析法作为一种快速灵敏、操作简单的免疫检测方法，适应于现场快速检测要求，在检测羊乳中是否掺牛乳成分的快速检测方法研究中有重要意义。本课题通过SDS-PAGE和native-PAGE对牛羊乳蛋白质的区别进行了详细比较；选用α-CN和β-CN为免疫原进行多克隆抗体的制备，得到的抗血清经过盐析和层析进行纯化；采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，优化胶体金标记抗体的最佳条件，标记的盐析IgG用于免疫层析试纸条金标垫的包被，NC膜用盐析IgG和羊抗兔IgG包被后，组装后得到α-CN和β-CN胶体金试纸条，对其进行特异性、灵敏性、检测限测试，证实试纸条可用于羊乳中是否掺有牛乳的检测。牛羊乳蛋白质区别比较。SDS-PAGE法条件下牛羊乳最主要的差别是酪蛋白，羊乳αs2-CN分子量大于牛乳αs2-CN分子量，羊乳αs2-CN含量较高，而牛乳αs1-CN含量较高；native-PAGE法条件下乳清蛋白分离好，羊乳有一条较大的羊乳清蛋白，而牛乳清蛋白有一条牛α-乳白蛋白，最下端有两条牛β-乳球蛋白，这是native-PAGE显示羊乳和牛乳蛋白质最明显的差别。比较而言，native-PAGE更能明显区分牛羊乳，当羊乳中掺入5%牛乳时，在native-PAGE电泳图谱中就可以看出明显差异。特异性多克隆抗体的制备。选用牛乳α-CN和β-CN为免疫原，对大白兔进行免疫，其中α-CN进行了三个浓度的免疫，采用颈动脉取血后得到的抗血清用饱和硫酸铵分级盐析法（50%、40%、33%）进行粗分离，再经过蛋白A亲和色谱柱得到层析抗体，经间接ELISA检测，制得的盐析抗体α-CN-IgG(1)、 α-CN-IgG(2)、α-CN-IgG(3)和β-CN-IgG的效价分别为1:16000、1:16000、1:32000和1:16000，层析抗体α-CN-IgG(1)、α-CN-IgG(2)、α-CN-IgG(3)和β-CN-IgG的效价分别为1:4000、1:8000、1:16000和1:8000，均具有较高效价；经SDS-PAGE检测，制得的抗体纯度达90%以上；用硫氰酸盐法测四种抗体与抗原α-CN和β-CN的相对亲和力，抗体α-CN-IgG(1)、α-CN-IgG(2)、α-CN-IgG(3)与抗原α-CN的相对亲和力分别为1mol/L、1mol/L、1.5mol/L，、β-CN-IgG与抗原α-CN的相对亲和力过低未测出，四种抗体α-CN-IgG(1)、α-CN-IgG(2)、α-CN-IgG(3)、β-CN-IgG与抗原β-CN的相对亲和力分别为1mol/L，1.5mol/L、1.5mol/L和4.5mol/L；用间接ELISA法测抗体与羊乳的交叉反应，四种抗体与羊乳均有一定程度的交叉反应，且β-CN-IgG与羊乳的交叉反应远远大于α-CN-IgG(1)、α-CN-IgG(2)、α-CN-IgG(3)与羊乳的反应。胶体金的制备。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金并确定制备的最佳条件为：在20mL0.01%四氯金酸溶液中加入400μL1%柠檬酸钠溶液，持续加热7min。通过实验确定四种盐析抗体α-CN-IgG(1)、α-CN-IgG(2)、α-CN-IgG(3)和β-CN-IgG的最佳标记量分别为52μL/mL、26μL/mL、52μL/mL和52μL/mL；最佳标记pH分别是6.0-6.5、8.0、6.0-6.5和7.5-8.0。用间接ELISA法测得四种免疫胶体金活性分别为1:600、1:1200、1:4800和1:1200，与标记前的1:16000、1:16000、1:32000和1:16000相比活性明显降低。胶体金免疫层析试纸条的制备。通过试验优化了试纸条金标垫和NC膜的处理方式，并最终建立了利用β-CN试纸条或α-CN试纸条检测羊乳中是否掺入牛乳的试验方法。对于β-CN试纸条，其金标垫的最佳处理是用金标抗体β-CN IgG-羊乳复合物溶液原液包被；NC膜C线用浓度为250mg/mL的羊抗兔IgG包被1.5μL；T线用十倍稀释的盐析β-CN IgG包被4μL。其对纯品β-CN的灵敏性为31.25μg/mL，羊乳中掺入牛乳的检测限为5%。对于α-CN试纸条，其金标垫的最佳处理是用金标抗体α-CN IgG（3）-羊乳复合物溶液原液包被；NC膜C线用浓度为250mg/mL的羊抗兔IgG包被1.5μL；T线用十倍稀释的盐析α-CN IgG包被4μL。其对纯品α-CN的灵敏性为62.5μg/mL，羊乳中掺入牛乳的检测限为10%。通过比较研究牛羊乳蛋白质的差别，为基于乳源蛋白质的免疫分析方法提供了依据。以牛β-CN和α-CN为抗原制备多克隆抗体，制备研制的免疫胶体金试纸条可实现羊乳中掺入牛乳成分半定量的检验，为羊乳掺假快速检验及羊乳及其制品质量控制奠定了基础。