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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的以母猪繁殖障碍和各个年龄段猪呼吸系统疾病为主要特征的传染性疾病。2006年,高致病性HP-PRRSV在我国迅速传播,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。2013年我国再次出现了新型PRRSV变异株NADC30-Like-PRRSV,该毒株虽致病性低于HP-PRRSV,但极易与其它类型PRRSV毒株发生基因重组。近年来,NADC30-Like-PRRSV在我国许多规模化猪场存在与流行,成为了新的优势毒株。猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）可感染各年龄段猪群,造成猪繁殖障碍、仔猪神经系统和呼吸系统疾病。在2011年,国内出现了毒力更强的PRV变异毒株,接种过Bartha-K61疫苗的猪场也相继暴发新的PR疫情,严重地威胁我国生猪产业持续健康发展。目前,PRRS和PR的防控主要还是依靠疫苗免疫,然而PRRS和PR的经典疫苗不能对猪群提供完全保护,故急需安全有效的新型疫苗对两种疫病进行防控以及净化。为了制备安全有效且能同时防控PRRS和PR的新型疫苗,本研究拟将改造后的PRV弱毒株作为载体,以PRRSV主要抗原基因ORF5为外源基因构建重组病毒株,以期该重组病毒能够保护猪群免受PRRSV和PRV的攻击,成为能同时防控PRRS和PR的疫苗候选株。为了调查目前河南地区PRRSV的流行态势,本研究于2019到2022年采集河南省25个猪场疑似PRRSV感染的发病猪血清、肺脏等样本,共计110份,进行PRRSV检测并扩增其ORF5基因分析其亲缘性和变异性。结果显示,PRRSV总阳性率为29.09%,从阳性样本中共扩增得到的16条PRRSV ORF5基因序列,与参考序列间的核苷酸和氨基酸同源性分别为82.3%-99.3%和54.3%-99%。遗传进化分析结果显示本研究获得的15条PRRSV GP5序列在Lineage1组,与参考序列HENAN-XINX亲缘性最近。1条序列属于Lineage 8.7组,与HUN4亲缘性最近。提示河南地区的主要流行毒株为HP-PRRSV和NADC30-Like-PRRSV。本研究扩增HP-PRRSV的ORF5基因,并通过BamH I位点与实验室保存的PRV转移载体p G相连接,成功构建了转移载体p G-GP5/HP-EGFP。利用同源重组技术经10轮的蚀斑纯化,成功获得重组病毒rPRV-GP5/HP-EGFP。使用CRISPR/Cas9-EGFP敲除质粒剪切EGFP部分基因,最终获得重组病毒rPRV-GP5/HP。RT-PCR、间接免疫荧光、Western blot试验结果显示ORF5基因成功转录并得到表达。另外,为了构建表达HP-PRRSV和NADC30-Like-PRRSV ORF5基因重组猪伪狂犬病病毒,扩增NADC30-Like-PRRSV ORF5基因,通过Bam H I和Hind III位点插入真核表达载体p BApo-EF1α＿Pur＿DNA,构建p BA-GP5/NA。并扩增p BA-GP5/NA载体表达盒,利用无缝克隆技术进行连接,成功构建转移载体p G-GP5/HP-GP5/NA-EGFP。然后在CRISPR/Cas9-g G载体的辅助下,通过同源重组技术将两个ORF5基因重组到rPRV-g E-/g I-/TK-三缺失株中,最终获得重组病毒rPRV-GP5/HP。通过RT-PCR、间接免疫荧光、Western blot试验验证,初步判定两个位点的ORF5基因都同时得到了转录和表达。本研究对两株重组病毒的理化特性、生长特性和遗传稳定性进行分析,结果表明两株重组病毒与亲本株培养特性相似,说明外源基因的插入以及复杂的重组过程对病毒的本身无影响,且两株重组病毒具有良好的遗传稳定性。本研究选用三周龄PRV和PRRSV抗原抗体双阴性仔猪作为动物模型,使用重组病毒rPRV-GP5/HP和rPRV-GP5/HP-GP5/NA对仔猪进行免疫,并设立PRRSV疫苗对照组和DMEM空白组。两株重组病毒均能刺激仔猪产生较高水平的PRV ELISA抗体和中和抗体,与商品化疫苗免疫效果相同。但两株重组病毒免疫仔猪后仅能检测到一定的ELISA抗体,抗体水平略低于商用疫苗。未检测到中和抗体,其原因尚不清楚,可能与蛋白表达量或GP5蛋白表位无法充分暴漏有关,后续还需进行进一步的探究。攻毒保护试验结果表明两株重组病毒均能对PRV和PRRSV强毒的攻击提供一定的保护效果,并能有效的抑制各个脏器中病毒的增殖。综上所述,本研究成功获得了两株重组病毒rPRV-GP5/HP和rPRV-GP5/HP-GP5/NA,并对其生物学特性和免疫原性进行了探究,以期为PRRS和PR的防控提供有力的工具,为新型疫苗的研究和开发提供一定的理论支持。