隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种主要感染肠上皮的细胞的顶复门原虫。隐孢子虫感染在全球各地都有报道,隐孢子虫是导致全球儿童和艾滋病患者腹泻的主要原因,尤其对一些发展中国家以及资源贫乏地区的儿童影响极为严重。由隐孢子虫引起的隐孢子虫病通常会引起儿童的发育迟缓,对免疫力低下或缺失的人群可导致脱水性腹泻。目前,已鉴定出的近44个隐孢子虫有效虫种,其中微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）目前被认为是在人与家畜之间通过粪口途经传播相关的重要虫种。C.parvum的感染通常是通过卵囊的摄入,如人和其他动物通过直接接触或者食用受污染的水或者食物。卵囊在进入肠道后释放出有感染能力的子孢子,进而感染肠道上皮细胞,在整个过程中子孢子会分泌多种糖蛋白参与入侵。微小隐孢子虫gp40蛋白是卵囊脱囊后子孢子在入侵宿主细胞过程中被鉴定到的分泌蛋白,在入侵过程中发挥着重要的作用。目前,关于gp40蛋白与宿主细胞蛋白互相作用的分子机制尚不清楚。因此,本研究首次通过GST-Pull down和LC-MS/MS技术筛选了HCT-8细胞蛋白与Cpgp40蛋白存在潜在互作可能的蛋白,并验证可能的互作关系,初步探究了受体蛋白在C.parvum子孢子体外黏附入侵中的功能特点,为进一步研究相关入侵机制以及畜牧业对隐孢子虫感染的预防和研发隐孢子虫病相关药物等奠定基础。本研究首先将C.parvum gp40基因构建到带有GST标签蛋白的原核表达载体p GEX-4T-1上,通过将重组质粒导入表达菌中,利用原核表达系统,在37°C,1 m M IPTG条件下诱导表达,并成功表达出重组GST-Cpgp40蛋白和对照GST蛋白,并采用SDS-PAGE和Western blot技术对重组GST-Cpgp40蛋白进行了检测鉴定。通过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析得到纯度较高的重组gp40蛋白,并且成功制备了anti-GST-Cpgp40的兔多克隆抗体,为后续试验的开展与研究做好准备。在得到纯化的蛋白之后,我们通过GST-Pull down技术和蛋白质谱共鉴定26个蛋白,根据韦恩图的结果分析,共筛选出14个与Cpgp40蛋白存在互作可能的蛋白,他们大多都分布在细胞的细胞膜和细胞骨架上。我们检测了蛋白质谱结果中位于细胞膜和细胞骨架的几个蛋白对应的m RNA水平在C.parvum入侵HCT-8细胞不同时间点的变化情况,发现ENO1基因的水平在C.parvum入侵后3h显著下调,这一时间点正是黏附入侵阶段。值得注意的是,ENO1在寄生虫的侵染中研究较多,且主要参与细胞外基质的降解,因此根据试验结果和生物信息学分析,我们选择ENO1蛋白作为后续试验研究。随后,我们利用双分子荧光互补试验和免疫共沉淀试验成功验证Cpgp40蛋白和HCT-8细胞的ENO1蛋白的体外互作,为下一步试验奠定了基础。我们进一步发现anti-ENO1抗体以及si-ENO1能够对C.parvum的入侵具有阻断作用,说明ENO1在入侵过程中发挥着一定的功能。同时外源蛋白的加入以及过表达载体转染也说明ENO1蛋白对C.parvum入侵具有促进作用。此外,通过我们对入侵前后细胞层连蛋白和黏连蛋白的m RNA和蛋白水平的检测,以及对ENO1蛋白功能氨基酸进行定点突变,进一步证明了ENO1蛋白参与C.parvum入侵宿主过程中的细胞质外基质的降解和细胞内的糖酵解过程可能进一步影响C.parvum内生发育阶段的供能等过程。当然还需要进一步的研究来充分了解ENO1在C.parvum入侵宿主中参与的相关通路调控的具体作用和功能机制。综上所述,本论文初步探究了微小隐孢子虫gp40蛋白与宿主细胞蛋白的互作,为研究微小隐孢子虫入侵机制奠定了基础。