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马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）病毒在世界范围内广泛分布,能侵染多种重要经济作物,造成严重的病害和产量损失。芸薹黄化病毒（Brassica yellows virus,BrYV）是由本实验室首次发现的一种能侵染十字花科多种作物的马铃薯卷叶病毒属新病毒。与该属其他病毒类似,其基因组具有6个开放阅读框（open reading frame,ORF）,其中ORFO编码P0蛋白。目前,该属已有多个P0蛋白作为RNA沉默的抑制子被报道,但各个P0蛋白之间沉默抑制能力存在较大差异,而具体的抑制机制依然不是很清楚。对BrYV-A基因型P0蛋白（P0BrA）的RNA沉默抑制功能进行了研究。首先,通过共注射实验表明P0BrA除了能抑制由单链RNA所诱发的局部沉默以外,还能抑制由双链RNA所诱发的局部沉默以及由单链RNA所诱发的系统沉默,并证明在此过程中P0BrA能够同时抑制初级小分子干扰RNA（small interfering RNAs,siRNAs）和次级siRNA的有效积累。同时,结合一系列代表性的单点突变鉴定出P0BrA的关键功能氨基酸。例如,P0BrA的184位的亮氨酸突变为丙氨酸时,导致P0BrA不能抑制24 nt siRNA的积累,并丧失了系统沉默抑制功能,但仍具有抑制局部沉默的能力。然而,当P0BrA的63位和64位的亮氨酸和脯氨酸组成的类F-box基序都突变为丙氨酸时,不能抑制21/22 nt siRNA的有效积累,局部沉默抑制功能丧失,但仍然具有抑制系统沉默的能力。这些结果表明,21/22nt siRNA可能主要参与局部沉默,而24nt siRNA则可能与系统沉默相关。总之,P0BrA能够同时抑制初级和次级21nt、22nt以及24ntsiRNAs的产生,是抑制功能强大的基因沉默抑制子。在以上实验结果的基础上,试图对P0BrA的RNA沉默抑制的分子机制进行初步探索。实验结果表明,POBrA和已报道的其他病毒编码的P0蛋白一样,能介导拟南芥AGO1蛋白的降解。然而,我们通过P0BrA点突变体的功能和AGO1降解实验,发现P0BrA对系统沉默的抑制作用并不依赖其对AGO1蛋白的降解,可能有其他机制的参与。首先,对本生烟的三种Dicer类似蛋白（Dicer like protein,DCL）转录水平进行检测,结果表明瞬时表达P0BrA及其突变体L63A/P64A能导致DCL3基因转录水平的下调。通过dsRNA体外切割实验,发现P0BrA及其突变体L63A/P64A能促进植物蛋白提取物对dsRNA的切割,但切割产物siRNA的积累量降低。同时,电泳迁移率实验的初步结果表明P0BrA不具有双链RNA结合活性。由此推测,除了介导AGO蛋白降解之外,P0BrA还可能影响上游的DCL对双链RNA的切割过程,但此抑制过程与长的双链RNA结合无关。明确了 P0BrA主要为细胞质分布,并观察到其与拟南芥的RNA依赖的RNA聚合酶6（RNA-dependent RNA polymerase 6,RDR6）以及基因沉默抑制子 3（suppressor of gene silencing 3,SGS3）共定位。利用免疫共沉淀实验,验证了 P0BrA与拟南芥SGS3蛋白之间存在互作或关联。同时,P0BrA能干扰反式作用siRNA（trans-acting siRNA,tasiRNA）的生物合成。以上结果暗示,P0Brt还可能作用于RNA沉默途径的siRNA扩增阶段。除了 RNA沉默抑制能力之外,还发现P0BrA能在本生烟叶片上诱发局限性坏死反应。该坏死反应与P0BrA的局部沉默抑制作用无关,并伴随活性氧的产生及病程相关基因1（pathogenesis-related gene1,PR1）的诱导表达,而水杨酸处理能推迟该坏死反应。此外,还通过酵母双杂交系统,以POBrA为钓饵从拟南芥cDNA文库中筛选得到5个候选互作蛋白;并利用免疫沉淀结合质谱分析的方法筛选到了 6个可能与P0BrA互作或关联的候选本生烟蛋白。同时,从呼和浩特市感病马铃薯中发现并鉴定了一种能侵染马铃薯的香石竹潜隐病毒属（Carlavirus）新病毒,暂命名为马铃薯H病毒（Potato virusH,PVH）。通过测定和分析PVH病毒全长基因组序列,发现其基因组结构符合Carlavirus特征,但与同属病毒相比,PVH复制酶和外壳蛋白核酸或氨基酸序列一致性均低于70%。在基于复制酶和外壳蛋白序列所构建的系统发育进化树中,PVH区别于同属其他病毒形成独立的进化分支。通过制备PVH的特异性兔抗血清,分析发现PVH与同属几种侵染马铃薯的病毒之间没有血清学关系。PVH具有特异的寄主范围,并能与多种马铃薯病毒复合侵染马铃薯。PVH病毒粒子为长而微弯曲的线状,符合Carlavirus病毒的特征。以上证据均支持PVH成为Carlavirus中一个独立的新种。此外,初步结果还表明PVH编码的富半胱氨酸蛋白有弱的局部沉默抑制活性,并导致PVX重组病毒症状加重。