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种主要苦参类生物碱保肝利胆和体外抗HBV的比较
研究及其对蛋白酪氨酸激酶的影响
目的:对几种主要苦参类生物碱保肝利胆和体外抗HBV的作用进行比较研究,以期发现比目前临床在用的保肝利胆和抗HBV疗效更好的苦参类生物碱,并探讨其作用机理。
方法:实验分为四部分,第一部分,保肝利胆实验:采用异硫氰酸萘酯(ANIT)诱导的小鼠急性淤胆性肝损伤模型,实验分正常组、模型组、药物干预组、阳性药物(甘草甜素)对照组,连续染毒两次,腹腔注射给药,每天一次,连续三天,定期观察小鼠一般情况,最后一次给药后禁食18h,处死后称量体重和肝脾重量,取血检测血清ALT、AST、TBIL、CHE,取肝组织行常规HE染色;第二部分,体外抑制CHE、ALT和AST活性实验:取各药物的高、中、低浓度液与等量混合血清置37℃水浴中孵育10分钟和24小时,以不含药而只加等体积的稀释液为对照,取样进行CHE、ALT和AST活性检测。第三部分,体外抗HBV实验:采用HepG2.2.15细胞模型,实验分为空白组、细胞对照组、药物干预组(分为不同浓度组)、阳性药物(拉米夫丁)对照组,收集第9天培养上清,检测上清中HBsAg、HBeAg、Pre-sl和HBVDNA改变,并用MTT法检测药物对细胞的毒性。第四部分,机理探讨:实验采用HepG2.2.15细胞模型,药物干预后,收集培养细胞,提取细胞内总蛋白,用ELISA法检测细胞内总蛋白酪氨酸激酶(PTK)的变化。
结果:第一部分,保肝利胆实验:对ANIT诱导的小鼠急性淤胆性肝损伤模型,小鼠死亡率比较:槐胺碱>槐定碱>槐果碱>甘草甜素>苦豆碱、苦参素和苦参碱>肝炎灵;对降低ALT效果比较:肝炎灵>苦豆碱>苦参素>苦参碱>甘草甜素>槐果碱>槐定碱>槐胺碱;对降低AST效果比较:苦豆碱>肝炎灵>苦参碱>苦参素>甘草甜素>槐果碱>槐定碱>槐胺碱;对降低TBIL效果比较:肝炎灵>苦豆碱>苦参碱>槐果碱>槐定碱>苦参素>甘草甜素>槐胺碱;第二部分,体外抑制CHE、ALT和AST活性实验:药物与血清共孵育10分钟后,在浓度为1mg/ml时,肝炎灵原液和苦参碱对CHE活性有明显的抑制作用,差异具有显著性(p<0.05);孵育24小时后,对CHE活性无明显影响,无统计学意义;在低浓度(2μg/ml)时,肝炎灵、苦豆碱和苦参碱对CHE活性反而有促进作用,差异具有显著性(p<0.05)。药物与血清共孵育10分钟后,在浓度为1mg/ml时,苦豆碱对血清ALT活性有明显的抑制作用,差异具有显著性(p<0.05)。孵育24小时后,高浓度时苦豆碱、苦参碱、槐定碱和肝炎灵原液能明显抑制血清ALT活性(p<0.05);在中浓度时苦参碱、槐果碱和甘草甜素也能明显抑制血清ALT活性,差异具有显著性(p<0.05)。药物与血清共孵育24小时后,高浓度时肝炎灵原液能明显抑制血清AST活性,差异具有显著性(p<0.01);在中浓度时苦豆碱也能明显抑制血清AST活性,差异具有显著性(p<0.05);在低浓度时,肝炎灵和苦参素也能明显抑制血清AST活性,差异具有显著性(p<0.05)。第三部分,体外抗HBV实验:对HepG2.2.15细胞模型,各苦参类生物碱对细胞上清HBsAg均有一定的抑制效果,其抑制率比较:肝炎灵>苦豆碱>槐果碱>槐胺碱>槐定碱>苦参素>苦参碱>拉米夫定;各苦参类生物碱对细胞上清HBeAg也有一定的抑制效果,其优劣比较如下:肝炎灵>苦豆碱>槐果碱>槐胺碱>槐定碱>苦参素>苦参碱>拉米夫定;各苦参类生物碱对细胞上清HBVDNA的抑制效果均较差,明显差于拉米夫定,除苦参素在0.001M浓度下有69%的抑制率外,其余苦参类生物碱对细胞上清HBVDNA几乎无抑制效果,其细胞上清HBVDNA分泌量甚至高于细胞对照组;各苦参类生物碱在浓度为0.001M时对细胞上清Pre-sl也有一定的抑制效果,抑制率比较:肝炎灵=槐定碱>苦参素>苦参碱>槐果碱>苦豆碱>槐胺碱>拉米夫定;第四部分,机理探讨:各苦参类生物碱对细胞内总蛋白酪氨酸激酶(PTK)均有一定的抑制效果,各组药物对PTK活性抑制比较:苦豆碱>肝炎灵、槐定碱>拉米夫定>槐胺碱>槐果碱>苦参素>苦参碱。
结论:各苦参类生物碱的保肝利胆效果中肝炎灵和苦豆碱降低ALT作用最佳;肝炎灵、苦豆碱和苦参碱降低TBIL最佳;苦参素保肝利胆效果较差,而槐果碱、槐定碱和槐胺碱在实验药物剂量下所致的小鼠死亡率最高;部分苦参类生物碱能在体外直接抑制CHE活性,以肝炎灵原液和苦参碱最为明显,而苦参素等其它生物碱在体外对CHE活性无明显抑制作用,结合文献报道,可以认为,肝炎灵中含有强力CHE活性抑制剂,而临床上部分苦参制剂所致的CHE下降可能只是该制剂的副反应;本研究还首次发现,苦豆碱、苦参碱、槐定碱、槐果碱和肝炎灵原液能在体外直接抑制血清ALT活性;苦豆碱、苦参素和肝炎灵还能在体外直接抑制血清AST活性;提示这些生物碱保肝降酶的机理可能是直接抑制血清ALT和AST活性;各苦参类生物碱均有不同程度的体外抗HBV作用,但结果表明其对病毒蛋白(HBsAg、HBeAg和Pre-1)分泌有更好的抑制效果,而对细胞上清HBVDNA除苦参素有一定的抑制效果外,其余生物碱的抑制效果较差。这可能提示:第一,苦参类生物碱抗HBV的作用靶点在蛋白水平,而不在基因水平;第二,临床上,将具有良好的抑制病毒蛋白分泌的各苦参类生物碱可以和具有良好抑制HBVDNA复制的药物(如核苷类似物或干扰素)联用,可能可以提高抗HBV疗效;肝炎灵具有良好的保肝作用和抑制病毒蛋白分泌的作用,而其它生物碱大多逊于肝炎灵,表明肝炎灵起作用的物质基础可能是其所含的其它生物碱和/或非生物碱成分和/或其所含的各种成分之间的协同作用,值得进一步研究;各苦参类生物碱对细胞内总蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性均有一定的抑制效果,相关分析表明,各苦参类生物碱的抑制PTK活性与其抑制HBsAg和HBeAg分泌成正相关,但与其抑制Pre-sl和HBVDNA分泌成负相关;至少说明,各苦参类生物碱所具有的良好的抑制HBsAg和HBeAg分泌的作用机理与其抑制PTK活性有关。