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支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia,BPD）属于慢性呼吸系统疾病,临床上以极早早产儿、极低出生体重儿多见。其主要特征是肺泡和肺血管生长发育障碍,该病在新生儿期死亡率较高,儿童期易出现反复发作的呼吸系统感染、肺通气和换气功能损害、肺动脉高压等疾病,严重影响了早产儿后期存活率和生活质量。BPD发病机制较为复杂,涉及遗传、早产、氧中毒、出生前和出生后感染、机械通气性肺损伤等多个方面,这些内源性和外源性刺激致使机体出现炎症级联反应,巨噬细胞和中性粒细胞在受伤的早产儿肺组织中积累,进而损伤未成熟的肺组织,损伤后肺组织的异常修复和肺血管发育的失控最终导致BPD的发生。显然,BPD的发病及进展的中心环节是多因素导致的炎症反应,而巨噬细胞的极化参与调控BPD的炎症反应。目前临床治疗BPD的方式有限,多数停留在对症治疗上。随着分子生物学的快速发展,对于BPD的研究逐渐深入到基因转录调控水平。微小RNA（micro RNAs,mi RNAs）属于机体的短序列非编码RNA,具有调控功能,通过碱基互补配对识别并结合靶基因m RNA,进而发挥降解靶基因m RNA或者抑制其翻译的功能。可见,编码蛋白的基因转录后受mi RNAs调控,最终影响蛋白的表达。近些年的研究显示,mi RNAs参与了BPD的发病。其中,mi R-382-5p能够降低机体的炎性细胞因子水平,抑制细胞凋亡,并且在新生BPD大鼠肺组织中出现异常表达。本研究分析了mi R-382-5p在BPD患儿血液、高氧诱导BPD小鼠肺组织及M1型极化巨噬细胞中的表达情况,进一步寻找其下游靶点,发现mi R-382-5p能够与下游靶点细胞周期依赖性蛋白激酶8（CDK8）结合,而CDK8已被证实能够激活信号转导和转录激活因子1（STAT1）,激活的STAT1通路能够促进巨噬细胞向M1型极化,促进炎症的产生。杨梅素（Myricetin）属于黄酮类化合物,生物学功能较广泛,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用。研究报道,在急性肺损伤、肺癌等肺部疾病中杨梅素的治疗有效。目前国内外有关mi R-382-5p在BPD中的具体作用机制、mi R-382-5p与CDK8的靶向关系及mi R-382-5p是否通过CDK8在BPD中发挥作用未见报道。本研究从分子水平探讨了BPD发病机制,并分析了杨梅素对BPD小鼠肺组织炎性细胞因子的影响,初步论证杨梅素能够减轻BPD小鼠炎症反应,为BPD的预防及治疗提供新的思路。第一部分mi R-382-5p抑制支气管肺发育不良M1型巨噬细胞极化及对STAT1通路的影响目的:1.明确在BPD中存在mi R-382-5p表达失调的现象。2.论证BPD中巨噬细胞极化的状态,从实验动物及细胞水平阐明在BPD中mi R-382-5p对巨噬细胞极化、炎性细胞因子及STAT1通路的影响。方法:1.BPD早产儿外周血mi R-382-5p表达水平选取2019年09月至2022年2月于河北医科大学第四医院和保定市第一中心医院新生儿科收治的早产儿44例为研究对象。根据2018年NICHD针对BPD的诊断标准,将研究对象分为BPD组和非BPD组,其中BPD组21例,非BPD组23例。所有患儿生后第1天采集静脉血2-3m L,采用RT-q PCR检测血清中mi R-382-5p的表达。2.BPD动物模型肺组织mi R-382-5p表达及巨噬细胞极化状态将足月新生C57BL/6小鼠随机分为两组:Control组和BPD组,每组各18只。出生后第3天（PN3）,BPD组小鼠置于高氧环境（85%oxygen）,Control组小鼠置于正常环境（21%oxygen）中。两组小鼠分别于出生第5天、第10天和第15天（PN5、PN10、PN15）处死并收集肺组织。RT-q PCR检测两组小鼠肺组织mi R-382-5p表达水平。免疫荧光双染检测两组小鼠肺组织PN15巨噬细胞生物标志物CD68和M1型巨噬细胞生物标志物CD86的表达。3.过表达mi R-382-5p对炎性细胞因子、巨噬细胞极化和STAT1影响常规培养RAW264.7巨噬细胞,将mi R-382-5p过表达慢病毒（LV-mi R-382-5p）和阴性对照慢病毒（LV-mi R-NC）分别感染RAW264.7巨噬细胞,加入20ng/m L IFN-γ和100ng/m L LPS诱导巨噬细胞M1型极化（制造炎症反应）。细胞分为四组:Control、IFN-γ+LPS、IFN-γ+LPS+LV-mi R-NC、IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p。应用RT-q PCR检测不同分组中mi R-382-5p的表达水平,验证过表达mi R-382-5p是否成功。ELISA检测炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6在细胞上清中的表达水平。流式细胞术检测M1型巨噬细胞生物标记物CD40和CD86的表达。Western blot检测细胞中STAT1和p-STAT1的表达。结果:1.BPD组早产儿血清中mi R-382-5p的表达水平（0.0080±0.0019）较非BPD组（0.0095±0.0022）明显下降（P=0.016）。2.PN5时间点:Control组和BPD组小鼠肺组织mi R-382-5p的表达水平差异无统计学意义（P=0.114）;PN10时间点:BPD组小鼠肺组织mi R-382-5p的表达水平较Control组降低（P=0.004）;PN15时间点:BPD组小鼠肺组织mi R-382-5p的表达水平较Control组降低（P=0.000）。免疫荧光双染显示,与Control组相比,生物标志物CD68和CD86阳性的巨噬细胞数量在BPD组明显增多。3.IFN-γ+LPS组mi R-382-5p的表达水平较Control组降低（P＜0.01）;IFN-γ+LPS+LV+mi R-382-5p组mi R-382-5p的表达水平较IFN-γ+LPS+LVmi R-NC组明显增高（P＜0.01）,证明过表达mi R-382-5p的细胞构建成功。IFN-γ+LPS组TNF-α、IL-6和IL-1β的水平较Control组升高（P＜0.01）;IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p组TNF-α和IL-1β的水平较IFN-γ+LPS+LV-mi RNC组降低,差异有统计学意义（P＜0.01）;IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p组IL-6的水平较IFN-γ+LPS+LV-mi R-NC组降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。与Control组相比,IFN-γ+LPS组细胞CD40和CD86的表达水平明显升高（P＜0.01）;与IFN-γ+LPS+LV-mi R-NC组相比,IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p组细胞CD40和CD86的表达水平明显减少（P＜0.01）。各组细胞中STAT1的相对表达量无显著性差异（P＞0.05）;与Control组相比,IFN-γ+LPS组p-STAT1的相对表达量升高（P＜0.01）;与IFN-γ+LPS+LV-mi R-NC组相比,IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p组p-STAT1的相对表达量降低（P＜0.01）。小结:BPD早产儿外周血及BPD新生小鼠肺组织中mi R-382-5p的表达水平均降低;BPD小鼠肺组织中巨噬细胞及其M1型极化的数量增多;诱导巨噬细胞M1型极化后mi R-382-5p的表达下降,过表达mi R-382-5p能够抑制M1型巨噬细胞的极化,抑制炎性细胞因子的释放;过表达mi R-382-5p能够下调p-STAT1的表达水平。第二部分mi R-382-5p靶向CDK8调控STAT1介导的支气管肺发育不良M1型巨噬细胞极化目的:探讨mi R-382-5p与CDK8的靶向调控关系,阐明mi R-382-5p通过靶向结合CDK8,调控STAT1对巨噬细胞M1型极化。方法:1.mi R-382-5p与CDK8靶向关系的验证通过双荧光素酶报告基因实验明确mi R-382-5p和CDK8的靶向关系。2.过表达mi R-382-5p对CDK8的影响mi R-382-5p过表达慢病毒（LV-mi R-382-5p）和阴性对照慢病毒（LV-mi RNC）分别感染RAW264.7巨噬细胞,加入20ng/m L IFN-γ和100ng/m L LPS诱导巨噬细胞M1型极化。将细胞分为四组:Control、IFN-γ+LPS、IFN-γ+LPS+LV-mi R-NC、IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p。应用RT-q PCR和Western blot检测细胞中CDK8的水平。3.BPD动物模型肺组织CDK8的表达将足月新生C57BL/6小鼠随机分为两组:Control组和BPD组,每组各18只。出生后第3天（PN3）,BPD组小鼠置于高氧环境（85%oxygen）中,Control组小鼠置于正常环境（21%oxygen）中。两组小鼠分别于PN5、PN10、PN15天处死,每组随机抽取6只C57BL/6小鼠,取小鼠肺组织。免疫荧光双染检测两组小鼠肺组织PN15时间点CDK8和巨噬细胞生物标志物CD68的表达和共定位情况。4.回复实验论证CDK8对mi R-382-5p介导的RAW264.7细胞M1型极化的影响培养RAW264.7巨噬细胞,将CDK8过表达慢病毒（LV-CDK8）及其阴性对照慢病毒（LV-NC）分别感染RAW264.7巨噬细胞。细胞分为三组:Control、LV-NC、LV-CDK8。RT-q PCR检测CDK8的表达,验证过表达CDK8慢病毒感染细胞的效果。将mi R-382-5p过表达慢病毒（LV-mi R-382-5p）和CDK8过表达慢病毒（LV-CDK8）、mi R-382-5p过表达慢病毒（LV-mi R-382-5p）和CDK8过表达阴性对照慢病毒（LV-NC）分别感染RAW264.7巨噬细胞,加入20n g/m L IFN-γ和100ng/m L LPS诱导巨噬细胞M1型极化。细胞分为四组:F N-γ+LPS?IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p?IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p+LV-NC?IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p+LV-CDK8?RT-q PCR检测细胞IL-6的表达?流式细胞术检测细胞CD40的表达?结果:1.双荧光素酶报告基因实验显示:mi R-382-5p mimics+CDK8 3’UTR WT组荧光素酶活性较NC mimics+CDK8 3’UTR WT组显著降低（P＜0.01）。mi R-382-5p mimics+CDK8 3’UTR Mut组和NC mimics+CDK8 3’UTR Mut组的荧光素酶活性没有发生明显变化。2.IFN-γ+LPS组CDK8的表达在m RNA和蛋白水平较Control组上调（P＜0.01）;IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p组CDK8的表达在m RNA和蛋白水平较IFN-γ+LPS+LV-mi R-NC组下调（P＜0.01）。3.BPD小鼠肺组织免疫荧光双染显示,生后第15天,与Control组相比,BPD组小鼠肺组织CD68阳性的巨噬细胞明显增加,CDK8在巨噬细胞中定位,且表达水平增加。4.回复实验显示:Control组和LV-NC组CDK8 m RNA的表达水平无显著性差异（P＞0.05）,LV-CDK8组CDK8 m RNA的表达水平较LV-NC组明显上调（P＜0.01）。表明过表达CDK8慢病毒感染细胞成功。IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p组IL-6 m RNA的表达水平较IFN-γ+LPS组降低（P＜0.01）;IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p+LV-CDK8组IL-6 m RNA的表达水平较IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p+LV-NC组升高（P＜0.01）。与IFN-γ+LPS组比较,IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p组细胞CD40的表达水平降低（P＜0.01）;与IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p+LV-NC组比较,IFN-γ+LPS+LV-mi R-382-5p+LV-CDK8组细胞CD40的表达水平升高（P＜0.01）。小结:mi R-382-5p与CDK8存在靶向关系;诱导巨噬细胞M1极化后CDK8的表达增加,过表达mi R-382-5p能够抑制CDK8的表达增加;BPD小鼠肺组织巨噬细胞数量增多,CDK8在巨噬细胞中存在定位,且表达水平升高;mi R-382-5p通过直接靶向结合CDK8抑制巨噬细胞M1型极化。第三部分杨梅素对支气管肺发育不良治疗作用的初步探讨目的:通过观察Control组、BPD组、杨梅素组不同时间肺组织的炎症指标,初步证实杨梅素能够减轻BPD炎症反应,为BPD治疗提供新的方向。方法:将足月新生C57BL/6小鼠随机分为三组:Control组、BPD组、杨梅素治疗组,每组各18只。出生后第3天（PN3）,BPD组及杨梅素组小鼠置于高氧环境（85%oxygen）中,Control组小鼠置于正常环境（21%oxygen）中。杨梅素组小鼠分别于PN5、PN10、PN15处死前一天给予杨梅素100mg/kg灌胃处理。三组小鼠分别于PN5、PN10、PN15时间点处死,每组随机抽取6只C57BL/6小鼠,采用ELISA检测肺组织中TNF-α、IL-6及IL-1β的水平。结果:PN5时间点,三组TNF-α、IL-6和IL-1β的水平差异无统计学意义（P＞0.05）;PN10时间点,杨梅素组TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平较Control组升高,较BPD组降低（P＜0.01）;PN15时间点,杨梅素组TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平较Control组升高,较BPD组降低（P＜0.01）。小结:杨梅素可以降低TNF-α、IL-6及IL-1β表达水平,进而减轻BPD小鼠肺组织的炎症反应。结论:1.mi R-382-5p在BPD早产儿外周血中表达下调。2.动物实验表明mi R-382-5p在BPD新生小鼠肺组织中表达下调;BPD小鼠肺组织中巨噬细胞及其M1型极化的数量增多,巨噬细胞中CDK8的表达水平升高。3.细胞实验证实过表达mi R-382-5p能够减轻M1型巨噬细胞炎症反应,抑制M1型巨噬细胞的极化和STAT1通路的激活。mi R-382-5p与CDK8存在靶向关系。mi R-382-5p通过靶向结合CDK8,下调CDK8表达,进而抑制STAT1通路激活,抑制STAT1介导M1巨噬细胞极化,缓解BPD炎症损伤。4.杨梅素可以减轻BPD小鼠肺组织的炎症反应。