背景/目的肾损伤是由多种病因引起的,也是诸多肾脏病共同的特点,主要分为急性肾损伤与慢性肾脏病两大类型。其病理过程主要表现为肾小管间质纤维化,这也代表着几乎所有慢性和进展性肾脏病包括肾病综合征共同的最终途径。但是,目前减缓慢性肾脏病进展和预防慢性肾脏病相关并发症的有效治疗方法是非常有限的,也没有针对性的治疗方法来减缓肾小管间质纤维化。其对于整个社会造成了巨大的负担,迫切需要一种切实有效的治疗手段。而中医药治疗肾病综合征具有多成分、多靶点、多途径的优势,探究中医药治疗手段具有重要意义。茵陈（Artemisia Capillaris）作为一味具有悠久使用历史的中药,被用于肾脏病的治疗在各种医籍中屡见不鲜。其也是著名中医周恩超教授治疗肾脏病的经验方——苏茵解毒方的君药之一,对于慢性肾脏病的治疗颇具疗效,但对于具体机制尚不清楚。本研究目的就是为了探究茵陈对肾病综合征的干预作用及潜在机制。方法网络药理学:基于中药系统药理学分析平台TCMSP中药“茵陈”的所有活性成分并收集所有符合条件的有效活性成分,利用基于GeneCards数据库、Drugbank数据库、OMI M数据库和PharmGkb数据库以及TTD数据库5个数据库检索肾病综合征的疾病相关靶点以及茵陈所有符合条件的有效活性成分对应靶点,筛选出共有靶点。利用STRING数据库构建蛋白互作（PPI）网络,接着利用Cytoscape软件对PPI网络进行拓扑分析,并对拓扑分析筛选出的共有靶点进行基因本体论（Gene Ontology,GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路分析。动物实验:①采用SD大鼠尾静脉单次注射阿霉素造模。适应性喂养一周,SD大鼠给与尾静脉注射阿霉素注射液6.5mg/kg造模,予以茵陈水提物冻干粉溶液（WAC）（分别按照成人15g/d给药）进行干预,设置空白对照组（给与生理盐水）,第35天处死并采集血、尿以及肾脏标本。②HE染色观察大鼠肾小管结构,Masson染色观察纤维胶原沉积,免疫组化观察大鼠肾脏组织Bcl2/Bax、Cleaved Caspase3/Caspase3的表达,免疫荧光检测大鼠肾脏组织ROS的表达。③利用全自动生化分析仪以及自动尿液分析仪检测血生化指标如白蛋白、肌酐、尿素氮以及尿液指标如尿ACR,并比较其组间差异。④免疫蛋白印迹法检测肾脏组织凋亡相关蛋白（如Bcl2/Bax、Cleaved Caspase3/Caspase3）、MAPK信号通路相关蛋白（如p-ERK/ERK、p-p38/p38、p-JNK/JNK）以及抗氧化蛋白SOD1的表达,并比较其组间差异。细胞实验:①利用不同浓度阿霉素干预大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52e）24h,利用光镜观察形态学变化,CCK-8检测法检测细胞活性,细胞流式术以及TUNEL法检测细胞凋亡,流式细胞术以及活性氧试剂盒检测ROS生成,免疫蛋白印迹法检测织凋亡相关蛋白、MAPK信号通路相关蛋白以及抗氧化蛋白SOD1的表达,并比较其组间差异。②不同时间（0,3,6,9,12h）下阿霉素干预NRK-52e细胞,利用活性氧试剂盒检测ROS生成,免疫蛋白印迹法检测织凋亡相关蛋白、MAPK信号通路相关蛋白以及抗氧化蛋白SOD1的表达,并比较其组间差异。③利用不同浓度（1,2,4mg·mL-1）茵陈水提物冻干粉溶液分别与不同浓度（0.25,0.5,1mg·mL-1）阿霉素溶液共同干预NRK-52e细胞24h,利用CCK-8检测法检测细胞活性,并选定最佳实验条件（4mg·mL-1茵陈水提物冻干粉溶液+1mg·mL-1阿霉素溶液）。利用TUNEL法检测细胞凋亡,免疫蛋白印迹法检测织凋亡相关蛋白、MAPK信号通路相关蛋白以及抗氧化蛋白SOD1的表达,活性氧试剂盒检测ROS生成,并比较其组间差异。④利用抗氧化剂NAC干预NRK-52e细胞24h,CCK-8检测法检测细胞活性,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫蛋白印迹法检测织凋亡相关蛋白、MAPK信号通路相关蛋白以及抗氧化蛋白SOD1的表达,活性氧试剂盒检测ROS生成,并比较其组间差异。结果网络药理学:①中药茵陈有效活性成分（OB≥30%,DL≥0.18）为异鼠李素、槲皮素、茵陈色原酮、去甲氧基茵陈色原酮、4-甲基茵陈色原酮、β-谷甾醇、芫花素、茵陈黄酮、异茵陈蒿黄酮、玄参黄酮、泽兰素、去甲泽兰黄醇素和阿特匹林A13个活性成分。②中药茵陈与肾病综合征的共同靶点主要AKT1、TNF、VEGF、IL-6、IL-1β、MAPK1、MAPK14、TP53等73个靶点。③中药茵陈与肾病综合征的共同靶点KEEG富集于TNF、PI3K-AKT、IL-17、NF-κB、P53、MAPK、Toll样受体信号通路、细胞凋亡和缺氧诱导因子（HIF-1）信号通路等。以上结果提示茵陈可能是通过调控TNF、AKT1、NF-κB、TP53、IL-6等关键靶点调控TNF、PI3K-AKT、IL-17、NF-κB、P53、MAPK、Toll样受体信号通路、细胞凋亡信号通路等来抑制肾脏细胞的炎症反应、细胞凋亡与增殖分化等途径来达到治疗肾病综合征的目的。动物实验:①动物实验第35天后取材,模型组（ADR组）SD大鼠表现为大量蛋白尿与肾功能（血肌酐、尿素氮、尿微量白蛋白肌酐比即尿ACR）降低,同时伴有血清白蛋白降低,而低剂量中药治疗组（ADR+低剂量WAC,WAC-L组）、高剂量中药治疗组（ADR+高剂量WAC,WAC-H组）较ADR组在蛋白尿与血肌酐、尿素氮、尿微量白蛋白肌酐比ACR均有不同程度的改善。②ADR组肾脏病理HE染色示肾小管细胞排列紊乱并肿胀,有大量蛋白管型,肾小球壁出现损伤,部分肾小球呈现不完整性;肾间质内有炎细胞浸润;MASSON染色示肾脏组织的胶原沉积显著,肾间质纤维化面积显著增加,而WAC-H组肾脏病理较ADR组HE染色、MASSON染色示肾小管、肾小球等肾脏组织结构得到了恢复,纤维化情况得到明显的改善。③通过肾脏组织氧化应激、MAPK信号转导通路以及细胞凋亡的相关检测显示,ADR组较Control组肾脏活性氧平均荧光强度明显升高,抗氧化蛋白SOD1明显下降,氧化水平升高,ERK、p38、JNK磷酸化水平升高,介导MAPK信号转导通路转导,Bcl2/Bax明显降低、Cleaved Caspase3/Caspase3明显升高,肾脏细胞凋亡水平上升,而WAC-L组、WAC-H组较ADR组氧化水平降低,抑制MAPK信号转导通路转导,降低肾脏细胞凋亡水平,WAC-H组尤为明显。以上结果提示:①中药茵陈对于SD大鼠阿霉素肾病的肾功能和蛋白尿具有改善作用,有效的降低血肌酐、尿素氮以及尿ACR水平,提高血清白蛋白水平。②中药茵陈具有保护肾脏结构,改善肾脏纤维化,抑制氧化应激、MAPK信号通路转导以及细胞凋亡,对SD大鼠的肾脏具有保护作用。细胞实验:①不同质量浓度阿霉素（0,0.25,0.5,1,2,4μg·mL-1）干预NRK-52e细胞24h后,光镜下观察细胞,发现NRK-52e细胞数目明显减少,间隙明显增大,形态皱缩变形,同时漂浮在培养液中的损伤细胞明显增加。以不同质量浓度阿霉素（0,0.25,0.5,1μg·mL-1）干预NRK-52e细胞24h后,流式细胞术、TUNEL染色以及Western Blot示随着阿霉素质量浓度的升高,NRK-52e细胞凋亡水平上升。以上结果均提示阿霉素诱导细胞凋亡,有剂量与时间依赖性。Western Blot示随着阿霉素干预时间（0、3、6、9、12h）增加,细胞凋亡水平也会上升。②不同质量浓度阿霉素（0,0.25,0.5,1μg·mL-1）干预NRK-52e细胞24h或阿霉素不同干预时间（0、3、6、9、12h）后,ROS平均荧光强度升高,抗氧化蛋白SOD1表达降低,细胞氧化水平升高。流式细胞术示阿霉素干预时间（0、3、6、9、12h）增加,细胞的活性氧表达水平上升。以上结果均提示阿霉素所诱导的细胞损伤与细胞氧化水平成正比,阿霉素可以造成NRK-52e细胞氧化损伤。③在茵陈水提物冻干粉溶液（WAC）的安全剂量内,不同质量浓度的WAC分别与不同质量浓度的阿霉素（0.5,1,2μg·mL-1）干预处理NRK-52e细胞24h,CCK-8检测细胞活性示WAC对于阿霉素诱导的NRK-52细胞损伤有保护作用。取WAC（4mg·mL-1）与ADR（1μg·mL-1）联合干预NRK-52细胞24h后,光镜下见WAC可以改善ADR诱导的细胞损伤,流式细胞术、TUNEL染色以及Western Blot示WAC可以保护NRK-52e细胞。④不同质量浓度阿霉素（0,0.25,0.5,1μg·mL-1）干预NRK-52e细胞24h或阿霉素不同干预时间（0、3、6、9、12h）后,Western Blot示ERK、p38、JNK磷酸化水平升高,介导MAPK信号通路转导,而WAC与ADR联合干预细胞可以抑制阿霉素诱导的MAPK信号通路的转导,结合以上结果提示WAC可以通过抑制MAPK信号通路转导以保护肾小管上皮细胞。⑤在抗氧化剂NAC的安全浓度范围内,NAC（5mmoL）或WAC与ADR联合干预NRK-52e细胞,荧光染色、TUNEL染色法以及Western Blot示NAC、WAC能降低阿霉素诱导的ROS平均荧光强度,提高抗氧化蛋白SOD1的表达水平从而抑制氧化应激,降低ERK、p38、JNK磷酸化水平,抑制MAPK信号通路的转导,降低Cleaved Caspase3/Caspase3,升高Bcl2/Bax,抑制细胞凋亡,提示WACNAC能通过抑制细胞氧化应激介导MAPK信号通路的转导从而抑制细胞凋亡以保护肾小管上皮细胞。以上结果提示:①阿霉素能诱导NRK-52e细胞凋亡导致细胞损伤。②阿霉素能提高NRK-52e细胞氧化水平以造成氧化损伤。③WAC能改善ADR诱导的NRK-52细胞凋亡。④ADR能介导NRK-52e细胞MAPK信号通路转导,WAC能抑制MAPK信号通路以起保护作用。⑤WAC能抑制氧化应激介导MAPK信号通路转导以调控细胞凋亡以保护NRK-52e细胞。结论茵陈能有效的保护肾功能,减少蛋白尿,提高血清白蛋白水平,显著保护肾脏结构,改善肾脏纤维化,降低肾脏组织氧化水平,抑制MAPK信号通路转导,降低细胞凋亡水平。其潜在机制可能是通过降低NRK-52e细胞氧化水平,介导MAPK信号通路转导,降低其小关蛋白磷酸化水平,从而减轻细胞凋亡水平。