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股骨头坏死是多种病因破坏股骨头血液供应所造成的最终结果。除创伤原因外,激素所引起的医源性股骨头坏死越来越多见,其具有起病短,进展快,易塌陷,预后差的特点,多数患者一旦发病,就将遵循“缺血—坏死—塌陷—骨性关节炎”的发展规律,发病过程可以从数月到数年不等,患者因而致残,丧失劳动与生活能力,危害十分严重,因而成为骨伤科治疗上的疑难重症。流行病学调查显示使用激素后3~6个月为发病高峰;长期服用激素,其股骨头坏死发病率为10%~30%。股骨头坏死的发病机制非常复杂,目前学术界存在多种学说,但究其本质,均为股骨头局部血液循环障碍,营养物质和氧供给减少,代谢产物不能及时清除,骨组织、细胞缺氧,久而久之骨细胞发生变性坏死,而坏死的股骨头组织内血管再生和新骨形成明显减弱。因此采取有效手段促进坏死区血管再生和新骨形成是保守治疗股骨头缺血性坏死的关键,对于股骨头坏死的治疗尤为重要。在股骨头坏死发病前期及时消除或阻断致病因素的作用,阻止该病的发生,进行一级预防是目前认为最积极、最有效的预防措施;而对于已经确诊为股骨头坏死的患者,早期股骨头坏死因为病变比较轻微,如果及早采取有效治疗,则可以截断骨坏死的进程,恢复股骨头的组织结构。祖国医学历来主张预防为主。早在《素问·四气调神大论》中就强调“治未病”的重要性,张仲景在《金匮·脏腑经络先后篇》中又提出了“上工治未病”的观点。目前,股骨头坏死的保守疗法有很多种,但是关于神经阻滞疗法的研究比较少。我导师长期在临床上应用中药制剂脉络宁注射液配以一定比例的利多卡因、碳酸氢钠注射液(称之为脉络宁复合液)进行闭孔神经阻滞的方法治疗早期股骨头坏死,取得了满意的疗效,因此,我们进行了初步的动物实验。脉络宁为纯中药制剂,由牛膝、玄参、麦冬、金银花、石斛组成,具有活血化瘀、滋阴养血、清热解毒的功效。本实验研究的主要目的是观察脉络宁复合液神经阻滞治疗股骨头坏死的疗效,并初步探讨中药对激素性股骨头坏死的作用机理,为临床治疗奠定理论基础。为此,本课题拟从组织形态学、免疫组织化学、血脂三个方面进行研究。1.脉络宁复合液神经阻滞治疗大鼠激素性早期股骨头坏死组织形态学的实验研究1.1目的应用HE染色的方法,从组织形态学方面观察股骨头坏死的病理变化,检验脉络宁复合液阻滞闭孔神经治疗大鼠激素性早期股骨头坏死的疗效。1.2材料和方法30只Wistar雄性成年白化大鼠(贰级,由中国中医研究院实验动物中心提供,动物合格证号为SCXK(军)2002-001),体重290±20g。其中24只大鼠复制激素性股骨头坏死的动物模型:尾静脉注射内毒素10μg/kg 1次。注射内毒素24小时后,腹腔注射醋酸强的松龙20mg/kg.d,连续3天,每次间隔24小时。造模完成后随机分为激素模型组(以下称模型组)12只,脉络宁复合液治疗组(以下称治疗组)12只,其余6只即为空白对照组(以下称空白组)。治疗组从第4天开始在闭孔神经注射脉络宁复合液2ml/kg,3次/周,共8周;模型组和空白组常规饲养。治疗组、模型组和空白组并于造模后第9周的第一天取材,用0.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(1ml/100g),处死大鼠,取下大鼠右侧股骨头,用4%多聚甲醛(0.01MPBS液配制,PH值7.2~7.4)固定待检。制备石蜡切片,进行HE染色,光镜下观察坏死股骨头组织结构的病理变化,并通过图像分析仪对HE染色切片的空骨陷窝率、骨陷窝面积、骨小梁面积进行定量分析。对所得数据进行单因素方差分析。1.3结果和结论1.3.1结果1.3.1.1 HE染色光镜观察(1)空白组:①骨小梁整齐清楚、排列规则、致密饱满。②骨皮质及骨小梁中骨细胞清晰可见,核较大,位于中央,偶可见骨陷窝空虚。③潮线完整,钙化带与软骨下骨小梁连接完好。④髓腔内造血细胞丰富,形态正常。软骨下血管较丰富,管径较大的血管壁结构清晰。⑤骨小梁边缘成骨细胞数量较多,髓腔中破骨细胞数量较少。(2)模型组:骨小梁稀疏,瘦长,甚至有断裂现象,结构紊乱;骨小梁中可见部分骨细胞坏死,空骨陷窝较正常增多;髓腔内脂肪空泡增多;成骨细胞数量减少,骨小梁周边未见明显新骨沉积性生长;髓腔内多核破骨细胞数量增多。(3)治疗组:骨小梁较模型组变粗,数量增加,结构基本清晰;骨小梁中多数为正常骨细胞,少量为坏死骨细胞,空骨陷窝较模型组明显减少;髓腔内脂肪空泡较模型组减少,造血细胞数量较模型组增多;成骨细胞数量较模型组增多;髓腔内多核破骨细胞数量较模型组明显减少。1.3.1.2图像分析仪定量分析(1)模型组的空骨陷窝率、骨陷窝面积较空白组显著增加(P<0.05),骨小梁面积较空白组显著减少(P<0.05),说明模型复制是成功的。(2)治疗组的空骨陷窝率、骨陷窝面积较模型组显著下降(P<0.05),骨小梁面积较模型组数值上明显上升,但是组间比较无显著性差异(P>0.05),说明脉络宁复合液疗效显著。(3)治疗组在骨陷窝面积上与空白组比较无显著性差别(P>0.05),在空骨陷窝率、骨小梁面积上仍然有显著性差别(P<0.05),说明经过脉络宁复合液治疗以后,坏死的股骨头并没有完全修复到正常水平。1.3.2结论(1)内毒素加大剂量激素冲击给药可以造成大鼠股骨头坏死。(2)通过运用脉络宁复合液进行大鼠闭孔神经阻滞,治疗大鼠激素性早期股骨头坏死,可以增加骨小梁数量,增加成骨细胞及造血细胞数量,减少坏死骨细胞、空骨陷窝及多核破骨细胞数量,并且具有骨细胞保护作用,明显减轻骨坏死的程度。2.脉络宁复合液神经阻滞治疗大鼠激素性早期股骨头坏死免疫组织化学的实验研究2.1目的应用免疫组织化学的方法,观察各组大鼠股骨头组织中影响骨生长和修复的多种生长因子的不同,检验脉络宁复合液阻滞闭孔神经治疗大鼠激素性早期股骨头坏死的疗效,并进一步认识股骨头坏死病理表现的分子生物学基础。2.2材料和方法30只Wistar雄性成年白化大鼠(贰级,由中国中医研究院实验动物中心提供,动物合格证号为SCXK(军)2002-001),体重290±20g。其中24只大鼠复制激素性股骨头坏死的动物模型:尾静脉注射内毒素10μg/kg 1次。注射内毒素24小时后,腹腔注射醋酸强的松龙20mg/kg.d,连续3天,每次间隔24小时。造模完成后随机分为激素模型组(以下称模型组)12只,脉络宁复合液治疗组(以下称治疗组)12只,其余6只即为空白对照组(以下称空白组)。治疗组从第4天开始在闭孔神经周围注射脉络宁复合液2ml/kg,3次/周,共8周;模型组和空白组常规饲养。治疗组、模型组和空白组并于造模后第9周的第一天取材,用0.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(1ml/100g),处死大鼠,取下大鼠右侧股骨头,用4%多聚甲醛(0.01MPBS液配制,PH值7.2~7.4)固定待检。制备石蜡切片,进行血管内皮细胞生长因子(Vessel endothelial cell growth factor,VEGF)、骨发生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)、转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、Ⅷ因子相关抗原(Ⅷfactorfos-related antigen,Ⅷ-R Ag)的免疫组织化学SP法染色,利用图像分析仪分析VEGF、BMPs、TGF-β1的阳性面积比、阳性细胞数目比,Ⅷ-R Ag的微血管密度。对所得数据进行单因素方差分析。2.3结果和结论2.3.1结果(1)在VEGF的表达方面,治疗组阳性面积比、阳性细胞数目比高于模型组,低于空白组,阳性面积比三组之间数值有显著性差异(P<0.05);阳性细胞数目比治疗组与模型组比较差异显著(P<0.05),与空白组比较差异不显著(P>0.05)。(2)在BMPs的表达方面,治疗组阳性面积比、阳性细胞数目比明显高于模型组,低于空白组,三组比较差异均显著(P<0.05)。(3)在TGF-β1的表达方面,治疗组阳性面积比、阳性细胞数目比高于模型组,低于空白组,治疗组阳性面积比与模型组比较差异显著(P<0.05),与空白组差异不显著(P>0.05),治疗组阳性细胞数目比与模型组比较差异不显著(P>0.05),与空白组比较差异显著(P<0.05)。(4)在Ⅷ-R Ag的表达方面,治疗组微血管密度高于模型组,低于空白组,与模型组比较差异显著(P<0.05),与空白组差异不显著(P>0.05)。2.3.2结论(1)内毒素加大剂量激素冲击应用以后,股骨头内与骨修复与再生密切相关的生长因子VEGF、BMPs、TGF-β1、Ⅷ-R Ag的表达显著下调。(2)脉络宁复合液治疗后,生长因子VEGF、BMPs、TGF-β1、Ⅷ-R Ag表达均显著上调,说明脉络宁复合液促进了坏死股骨头内微血管及软骨细胞的生成,进而促进了新骨的生成。3.脉络宁复合液神经阻滞治疗大鼠激素性早期股骨头坏死血脂的实验研究3.1目的试通过大鼠血清中总胆固醇及甘油三酯的含量对比,初步分析脉络宁复合液治疗大鼠激素性股骨头坏死的作用机理。3.2材料和方法30只Wistar雄性成年大白鼠(贰级,由中国中医研究院实验动物中心提供,动物合格证号为SCXK(军)2002-001),体重290±20g。其中24只大鼠复制激素性股骨头坏死的动物模型:尾静脉注射内毒素10μg/kg 1次。注射内毒素24小时后,腹腔注射醋酸强的松龙20mg/kg.d,连续3天,每次间隔24小时。造模完成后随机分为激素模型组(以下称模型组)12只,脉络宁复合液治疗组(以下称治疗组)12只,其余6只即为空白对照组(以下称空白组)。治疗组从第4天开始在闭孔神经周围注射脉络宁复合液2ml/kg,3次/周,共8周;模型组和空白组常规饲养。治疗组、模型组和空白组大鼠一起于造模后第9周的第一天取材,用0.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(1ml/100g),剖开腹腔,从腹主动脉采血5ml,采集前禁食12h,分别放于各管中。4℃离心3500rpm,15分钟,分离血清,4℃冰箱保存,送望京医院生化检验室测定总胆固醇、甘油三酯。对所得数据进行单因素方差分析。3.3结果和结论3.3.1结果模型组总胆固醇、甘油三酯含量,显著高于空白组、治疗组;治疗组总胆固醇、甘油三酯含量,较模型组显著下降;甘油三酯含量各组组间比较差异显著(P<0.05);总胆固醇含量模型组与空白组比较差异显著(P<0.05)。3.3.2结论(1)内毒素加大剂量激素冲击给药后,大鼠血清内总胆固醇、甘油三酯含量明显升高,机体出现高血脂的现象。(2)应用脉络宁复合液进行活血化瘀、清热解毒治疗之后,大鼠血清内总胆固醇、甘油三酯含量降低,说明脉络宁复合液改善了大鼠高血脂的状况,恢复了脂代谢平衡。总结论1.运用内毒素加大剂量激素冲击给药可以造成大鼠激素性股骨头坏死。2.运用脉络宁复合液进行闭孔神经阻滞,治疗大鼠激素性早期股骨头坏死,可以增加骨小梁数量,增加成骨细胞及造血细胞数量,减少坏死骨细胞、空骨陷窝及多核破骨细胞数量,明显减轻骨坏死的程度。3.运用脉络宁复合液进行闭孔神经阻滞可以使与微血管及骨细胞生成密切相关的生长因子表达上调。4.运用脉络宁复合液进行闭孔神经阻滞可以促进坏死股骨头内微血管及软骨细胞的生成,进而促进了新骨的生成。5.脉络宁复合液闭孔神经阻滞具有骨细胞保护作用,有效地抑制了骨坏死的发展,从而减小股骨头坏死的范围6.运用脉络宁复合液进行闭孔神经阻滞可以改善激素引起的高血脂状况,恢复全身的脂代谢平衡,进而改善了股骨头局部的微循环,减轻脂肪在骨髓腔内堆积,有效地抑制骨坏死的发展。7.脉络宁注射液是纯中药制剂,由牛膝、玄参、麦冬、金银花和石斛等组成,具有活血化瘀、滋阴养血、清热解毒的功效。本实验结果说明脉络宁注射液与利多卡因、碳酸氢钠以一定比例配合,采用神经阻滞的方法,在治疗早期激素性股骨头坏死方面,疗效确定,为临床治疗提供了一定的理论根据。