研究背景前列腺癌是男性泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,也是导致全球男性癌症相关死亡的第六大原因,近年来我国前列腺癌发病率明显上升。前列腺癌发病隐匿,早期多无症状,晚期转移性患者占前列腺癌患者比重较大。从原发性前列腺癌进展到晚期转移性前列腺癌在很大程度上依赖于雄激素受体(androgen receptor,AR)调控的信号通路,因此雄激素剥夺治疗(androgen-deprivation therapy,ADT)是目前晚期转移性前列腺癌患者临床治疗的主要方法。ADT主要通过耗竭循环雄激素,进而阻断前列腺癌细胞赖以生存的AR信号通路,以此防止疾病进展。多数患者对ADT治疗早期有效,然而几乎所有患者在经过中位时间18～36个月后最终都会进展成去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC)。尽管CRPC患者血清雄激素水平较低,但临床研究发现大多数CRPC肿瘤细胞仍然依赖AR信号通路的重新激活进而促进肿瘤细胞的增殖和转移扩散。因此,靶向抑制AR的作用仍是CRPC治疗的基础。目前临床CRPC患者的主流靶向药物恩杂鲁胺(enzalutamide,ENZ)即为有效的AR途径抑制剂,但它同样对CRPC患者仅短期有效并很快产生耐药性。神经内分泌型前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer,NEPC)是 CRPC的一种特殊亚型,预后极差。其组织学特征是存在小而圆的细胞,细胞核突出,免疫组化染色神经内分泌标志分子嗜铬粒蛋白A(chromogranin A,CHGA)和突触素(synaptophysin,SYP)呈阳性,前列腺腺癌管腔细胞标志物AR和前列腺特异抗原(prostate-specific antigen,PSA)呈阴性,因此NEPC不依赖于AR信号通路。原发性NEPC并不常见,多由前列腺腺癌(prostate adenocarcinoma,AdPC)在ADT选择压力下经神经内分泌分化(neuroendocrine differentiation,NED)而来。NEPC恶性程度极高,发现即是晚期,患者中位生存时间不足一年,临床治疗方案有限,目前并无特效药。因此,探究NED形成的驱动分子对揭示NEPC发病机制、寻找准确灵敏的早期诊断指标和临床治疗靶点具有重要意义。前列腺癌由AdPC进展到NEPC在分子水平上表现为神经内分泌(neuroendocrine,NE)表型的获得和腺癌(adenocarcinoma,AD)表型的减少甚至丢失,目前对介导NED形成的具体分子机制还处在探索阶段。随着肿瘤分子靶向治疗研究的深入,谱系可塑性作为潜在的靶向治疗抵抗机制越来越受到重视。前列腺腺癌在去雄选择压力下经细胞可塑性状态重新进行谱系分化形成不依赖于药物靶点生长的NE样细胞逐渐被研究者认为是一种潜在的NEPC发病机制。SOX2(sex determining region Y-box 2)作为 SOXB1 转录因子家族成员之一,是多能干细胞中重要的转录调节因子,在维持干细胞多能性和介导神经元分化中发挥重要作用。以往研究表明,SOX2在临床NEPC样本中表达量明显高于CRPC和AdPC。另外,在前列腺癌及其淋巴结转移组织中可观察到SOX2和CHGA共表达。最近研究表明SOX2可促进TP53和RB1缺陷型前列腺癌细胞谱系可塑性形成和去势抵抗。那么,SOX2是否会直接介导NEPC的形成或者在AdPC向NEPC转化过程中起什么作用呢?本研究将围绕这一问题展开探讨。目的本研究以公共数据库测序数据生信分析为基础,旨在探究前列腺癌恶性进展的潜在驱动因子,并进一步探讨SOX2在NEPC进展中的作用及相关分子机制,为临床寻找新的NEPC早期诊断指标与治疗靶点提供理论依据。第一部分SOX2在前列腺癌进展中的作用方法1.获取TCGA数据库中34个CRPC临床样本和15个NEPC临床样本的RNA测序(RNA sequencing,RNA-Seq)数据及文献报道中模拟NEPC动态进展的一系列人源性肿瘤组织异种移植物(patient-derivedxenografts,PDXs)的RNA-Seq数据,分析差异基因表达变化并以Enrichr基因富集分析工具中的CHEA2016数据集分别对上调表达和下调表达的差异基因集进行转录调控分析。2.以前列腺癌雄激素敏感的细胞系LNCaP和CWR22RV1为研究对象,采用慢病毒转染技术,分别建立SOX2过表达的前列腺癌雄激素敏感细胞系LNCaP-SOX2和CWR22RV1-SOX2。采用实时定量聚合酶链式反应法(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测过表达效率。3.采用RT-qPCR和Western blot检测去雄和非去雄条件下SOX2对LNCaP细胞和CWR22RV1细胞AdPC谱系特异基因和蛋白表达的影响,并以RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)回复 LNCaP-SOX2 细胞中 SOX2 基因表达,Western blot检测对AdPC谱系特异蛋白表达的影响4.采用 RT-qPCR 和 Western blot 检测 SOX2 对 LNCaP 细胞和 CWR22RV1 细胞NE表型标志物(NE marker)基因和蛋白表达的影响,同时以RNAi抑制LNCaP-SOX2细胞中REST基因表达,RT-qPCR和Western blot法进一步检测NE marker基因和蛋白表达变化。5.采用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,Edu)标记法检测SOX2对LNCaP细胞增殖能力的影响。结果1.SOX2基因在NEPC临床样本中的表达水平明显高于CRPC样本,而在PDXs模型中,随去雄时间的延长,腺癌表型基因AR、NKX3-1和KLK3表达下降甚至消失,而SOX2在去雄12周后开始表达并持续升高至NEPC形成终末期。转录调控分析发现,SOX2与NEPC形成中下调表达的差异基因集的转录调控相关性较高。2.转染包载SOX2基因的慢病毒的LNCaP细胞和CWR22RV1细胞中SOX2基因mRNA表达量和蛋白表达水平明显高于阴性对照组且在抗生素筛选条件下细胞生长状态良好。3.过表达SOX2可明显抑制LNCaP细胞中AD marker AR、NKX3-1、PSA、ADAM7基因mRNA的表达和NKX3-1、PSA蛋白的表达,RNAi干扰LNCaP-SOX2细胞中SOX2表达后可促进AR、NKX3-1、PSA蛋白表达。同时,在CWR22RV1细胞中过表达SOX2可明显降低AR和FOXA1蛋白表达水平。4.在LNCaP细胞中单独过表达SOX2仅可促进EN02和SYP基因mRNA的表达和ASCL1蛋白的表达,但联合REST缺失可明显促进LNCaP细胞中SCG3基因mRNA的表达和SYP蛋白的表达。同样,在CWR22RV1细胞中过表达SOX2仅可促进部分NE marker的表达(如SYP和NSE)。然而,过表达SOX2并不能提高LNCaP细胞的增殖能力。第二部分SOX2抑制AdPC谱系特异基因的分子机制研究方法1.LNCaP-Lev细胞和LNCaP-SOX2细胞分别进行转录组测序,通过DEseq软件获得SOX2相关的差异表达基因,采用RT-qPCR验证测序数据准确性。另外,采用Meatascape对差异表达基因进行功能注释,并使用Enrichr基因富集分析工具中的CHEA2016数据集对差异表达的基因集进行转录调控分析。2.采用染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)获得与SOX2直接结合的DNA靶点序列并进行测序分析,通过MACS软件进行峰(peaks)提取,并以ChIPseeker软件包对提取的peaks在全基因组的分布进行注释。3.采用Western blot检测SOX2对LNCaP细胞和CWR22RV1细胞组蛋白甲基化水平的影响。4.采用Western blot检测SOX2对LNCaP细胞和CWR22RV1细胞LSD1总蛋白表达的影响并采用免疫荧光技术(immunofluorescence technique,IF)检测LSD1核蛋白表达,采用比色法检测SOX2对LSD1去甲基化酶活性的影响。5.用3mM pargyline分别作用于SOX2+和SOX-前列腺癌细胞系,采用比色法检测对LSD1酶活性的影响,采用Western blot检测LSD1抑制剂对AdPC谱系特异蛋白表达的影响。结果1.对LNCaP-SOX2细胞和LNCaP-Lev细胞基因表达谱分析共获得1295个差异表达的注释基因(筛选条件:fold change≥1.5且FDR≤0.05),其中上调基因889个,下调基因406个(LNCaP-SOX2 vs LNCaP-Lev)。对筛选出的差异表达基因进行聚类分析发现,LNCaP细胞中过表达SOX2可明显抑制AR、NKX3-1、KLK3、FKBP5、TMEFF2和ADAM7基因的表达,同时也可促进多能性基因CD24和KLF4和少部分NE marker(如EN02和CENPE)的表达。对下调表达的406个差异基因进行转录调控分析发现AR和FOXA1都是与该下调基因集转录调控相关性较强的转录因子。SOX2相关的下调差异表达基因集的基因功能注释结果显示与AR信号通路和多个表观遗传调控相关的功能显著富集。2.ChIP-seq共识别出2115个显著富集(P<0.001)的SOX2蛋白与DNA互作位点。peaks在全基因组的分布注释结果显示绝大部分peaks都落在了基因间区,而在我们所关注的AdPC谱系特异性基因的转录调控区并无peaks显著富集。3.Western blot结果显示在LNCaP细胞和CWR22RV1细胞中过表达SOX2可明显降低H3K4和H3K9单甲基化和双甲基化水平。4.过表达SOX2可促进LNCaP细胞和CWR22RV1细胞中LSD1总蛋白及LNCaP细胞核中蛋白表达。另外,过表达SOX2可以促进LNCaP细胞和CWR22RV1细胞中LSD1去甲基化酶活性。5.pargyline可明显抑制LNCaP细胞和CWR22RV1细胞中LSD1去甲基化酶活性,有趣的是,这并不能逆转SOX2对AdPC谱系特异基因的抑制作用,反而使抑制作用增强。6.pargyline可抑制LNCaP细胞和CWR22RV1细胞中LSD1的去甲基化酶活性,使H3K4和H3K9甲基化蛋白表达同时升高。结论1.公共数据库测序数据分析提示SOX2可能是NEPC进展的潜在驱动基因,SOX2在NEPC中的表达明显高于CRPC,且在NEPC形成早期即高表达,SOX2有望作为NEPC早期诊断指标。2.我们在体外成功构建了 SOX2过表达的细胞模型LNCaP-SOX2细胞和CWR22RV1-SOX2细胞,并进一步证明了 SOX2可以抑制AdPC谱系特异基因的表达并对NE表型的形成有较弱的促进作用。3.机制上,SOX2对AdPC谱系特异基因的抑制作用不是通过直接结合而是以LSD1介导的全局低甲基化方式抑制AdPC谱系特异基因的表达,未来LSD1有望成为NEPC患者临床治疗的新靶点。