溶瘤病毒是目前十分具有应用前景的恶性肿瘤治疗新策略之一。溶瘤病毒可以作为一种基因治疗的载体,经过基因工程改造后能够通过在肿瘤部位的特异性复制裂解肿瘤细胞,并且可以在复制过程中通过表达治疗基因进一步消灭肿瘤细胞。溶瘤腺病毒因具有感染宿主广、转基因效率高、安全易生产等优势在目前的临床研究中的应用最为广泛。然而,溶瘤腺病毒在进行基因治疗时仍存在一些应用限制:首先,溶瘤病毒无法进行静脉给药,因为病毒靶向性不足,具有严重的肝富集性,并且其无法穿透生理屏障,因此对胶质瘤等的治疗效果也受到很大程度的限制;其次,病毒的免疫原性较强,在体内容易激起针对于病毒的抗病毒免疫,而能够引起的抗肿瘤免疫有限。为了提升溶瘤腺病毒的靶向能力实现静脉全身给药,研究者利用多种策略对腺病毒进行修饰。课题组前期也针对溶瘤腺病毒开展了一系列基因工程修饰并显著提升了溶瘤腺病毒的靶向抗肿瘤作用。本论文则尝试利用近年来研究的热点生物载体─外泌体对我们前期改造的溶瘤腺病毒进行进一步修饰,以提升其靶向抗肿瘤能力。外泌体是一种细胞外囊泡,具有和亲本细胞相似的受体识别能力,近年来作为一种新型的药物载体受到了关注。另外,外泌体在病毒感染过程中作为病毒信息传递的一部分组成,可以将病毒的遗传物质装载进外泌体,并且随着细胞的分泌以及旁细胞的吸收,实现病毒的信息传递,促进病毒的感染。为了提升溶瘤腺病毒靶向治疗恶性胶质瘤的潜力,课题组前期设计构建了一种衣壳双修饰型溶瘤腺病毒（A4/K37）,虽然能够显著提升对胶质瘤细胞的感染和杀伤活性,却不能在原位模型中有效突破血脑屏障实现双级脑靶向的目的。近来,有研究报道肿瘤或干细胞来源的外泌体能够运载一些小分子药物穿透血脑屏障,因此,本论文设计利用神经干细胞源外泌体修饰上述基因工程改造的靶向溶瘤腺病毒,以提升溶瘤腺病毒突破血脑屏障及靶向胶质瘤细胞的能力。由于物理载入法会破坏外泌体的天然结构,导致外泌体内容物的流失,影响外泌体的生物功能,不适合于本研究,而外泌体和溶瘤腺病毒的粒径大小几乎没有差异,也不适合混合孵育法,因此本论文主要尝试通过病毒感染细胞后分离获取包含溶瘤腺病毒颗粒或组分的外泌体,并评价其用于恶性肿瘤治疗的潜力和相关机制探索。首先,我们采用了鼠神经干细胞C17.2作为外泌体来源,利用病毒感染细胞的过程获取包含病毒成分的外泌体。常规的溶瘤腺病毒对神经干细胞的感染能力普遍较差,然而通过对比发现A4/K37病毒对C17.2细胞的感染能力更为高效。使用A4/K37感染C17.2收取外泌体后,进行了密度梯度离心并收取4条密度带,通过筛选获得内部具有较多病毒蛋白和基因组的外泌体（Adexo）并对其进行鉴定,电镜、DOT BLOT以及测序等检测结果表明Adexo具有和C17.2细胞分泌的外泌体（exo）相似的物理性质,包括粒径、电位及物理形态等,内部几乎没有完整的病毒颗粒,是一种包含病毒蛋白和基因组等组分的外泌体。更有趣的是,这种外泌体,能够像病毒一样感染细胞,并且伴随感染过程生成具有生物学功能的子代病毒从而杀死肿瘤细胞,这说明我们成功设计并分离获得了一种“溶瘤”外泌体。获得“溶瘤”外泌体后,我们首先评价了其对恶性胶质瘤细胞的靶向感染和杀伤能力。体外结果显示,与A4/K37相比,Adexo对人恶性胶质瘤细胞U87具有更好的感染性和细胞杀伤活性。为了评价其体内作用,利用U87细胞建立了小鼠颅内肿瘤模型,并通过静脉给药的方式检测Adexo的肿瘤靶向能力及其对胶质瘤的治疗效果。结果显示与A4/K37相比,Adexo具有更好的肿瘤靶向性,能够穿过血脑屏障达到肿瘤部位,同时也具有更好的抑瘤效果,伴随着更多的病毒浸润以及肿瘤细胞凋亡水平的上调,延长了裸鼠的生存期。不同来源的外泌体被报道在抗肿瘤过程中能够发挥作用,例如肿瘤细胞来源的外泌体能够促进肿瘤干细胞的生长和迁移,而免疫细胞分泌的外泌体能通过免疫调节抑制肿瘤生长。因此,我们探索了神经干细胞来源的Adexo免疫激活的能力。首先,我们通过流式细胞术在体外分析了Adexo对巨噬细胞系RAW 264.7以及原代分离的树突状细胞（DCs）和NK细胞等抗原提呈细胞（APC）的激活能力,结果显示Adexo能够有效地激活RAW 264.7,同时对于DCs和NK也又一定的调节作用。由于胶质瘤细胞原位模型不利于免疫效果的评价,为了在免疫全能鼠上评价Adexo的免疫调节功能,我们选用了鼠肿瘤细胞系CT26和B16作为模型,通过对两种肿瘤模型进行短期给药,比较了Adexo和Ad（即A4/K37）在不同模型以及不同注射方式（瘤内和静脉）下对免疫细胞的激活效果。结果显示,不同注射方式对能够激活的免疫细胞类型基本没有影响,在两种肿瘤模型中Adexo相比于Ad都能够引起更多的固有免疫细胞的激活,这意味着在肿瘤治疗过程中Adexo可能会引起更强的抗肿瘤免疫。基于以上结论,我们希望进一步评价Adexo在免疫全能鼠肿瘤模型中的抗肿瘤效果以及在抗肿瘤过程中的免疫调节作用。由于外泌体及Adexo对鼠肿瘤细胞的感染和杀伤能力并不清楚,我们首先评价了Adexo在体外对两种细胞系的感染和杀伤效果。结果显示与Ad相比,Adexo在B16细胞系中展示了更好的感染性,在CT26细胞系中二者的感染性没有明显差别,同时对两种细胞系的杀伤效果,Ad和Adexo也没有显著差异。最后,我们选择在B16模型上进一步评价了Adexo的抗肿瘤效果,并分析其对肿瘤微环境的免疫调节机制。结果显示,Adexo相比于Ad具有更好的抗肿瘤效果和免疫激活作用,能够增加树突状细胞（DCs）的数量,激活CD4+T细胞和CD8+T细胞,同时显著降低瘤内M2型TAM的数量。更重要的是,Adexo显著地激活了B细胞,刺激系统性免疫应答的发生,并产生了针对于肿瘤的特异性抗体,提升了抗肿瘤免疫治疗效果。通过对Adexo和exo进行RNA测序,我们初步探究了Adexo激活B细胞可能的分子机制,推测Adexo可能是通过RNA促进了B细胞的激活以及抗肿瘤效果的提升。综上所述,本论文获得了一种具有“溶瘤”功能的神经干细胞源外泌体Adexo,并通过体内外分析其具体的性质和功能得出以下结论:Adexo既具有神经干细胞源外泌体的物理化学性质,能够在静脉注射后穿透血脑屏障到达肿瘤部位;也具有一定的免疫激活作用,激活机体抗肿瘤免疫的产生;也具有“溶瘤”功能,能够像病毒一样进行感染,并且能够生成完整的,具有生物活性的子代病毒。在Adexo的抗肿瘤过程中,是先通过外泌体的特有性质到达肿瘤部位并且激活固有免疫及适应性免疫应答,再通过感染肿瘤细胞后进行腺病毒的包装和复制,同时发挥病毒的溶瘤及基因治疗效果,进而发挥出更好的抗肿瘤效果。通过本篇论文的研究,进一步认识了神经干细胞源外泌体的抗肿瘤免疫调节功能,同时也为溶瘤腺病毒的靶向修饰提供了新的思路。