氧糖剥夺再灌注后Src激酶的变化及其可能机制的探讨

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目的:探讨缺血再灌注过程神经细胞内Src激酶的表达变化和活性改变,探讨其可能的机制和意义。方法:以小鼠神经瘤母细胞株N2a细胞为研究对象,给予氧糖剥夺再灌注干预,体外模拟缺血再灌注过程,采用MTT法检测细胞活性,应用免疫细胞化学方法观察Src激酶在细胞内定位及表达,应用QRT PCR检测Src mRNA的含量变化,同时采用Western blot方法检测Src总蛋白的表达及其不同位点Tyr527和Tyr416的磷酸化水平。结果:1.MTT结果提示,氧糖剥夺4小时后N2a细胞活性较同期正常组稍有减低,但差异不具有统计学意义;再灌注早期,再灌注6小时组和再灌注12小时组的细胞活性较同期正常组降低,差异均具有统计学差异(P<0.05);再灌注后期即再灌注24小时组,细胞活性较正常组出现显著下降,差异具有显著性统计差异(P<0.01)。2.免疫细胞化学结果提示,Src蛋白定位于N2a细胞的胞浆内,围绕在细胞核周围。氧糖剥夺过程中,Src蛋白的表达分布无明显变化,阳性反应呈浅棕色或棕色。而再灌注过程中,Src蛋白的阳性表达在再灌注12小时和24小时出现增多,部分阳性反应呈深棕色。3. QRT PCR结果提示,与正常组比较,缺血4小时组和再灌注6小时组Src mRNA的表达出现减低,差异有统计学意义(P<0.05)。随着再灌注时间的延长,Src mRNA的表达逐渐回升,其中再灌注24小时组Src mRNA的表达明显上调,与正常组对比,差异具有统计学意义(P<0.05)。4. Western blot结果显示,与正常组比较,氧糖剥夺4小时组、再灌注6小时组和12小时组的Src总蛋白表达水平无明显改变(P>0.05),再灌注24小时组Src总蛋白的表达较正常组出现增多,其差异具有统计学意义(P<0.05)。另一方面,不同位点发生磷酸化的Src蛋白则变化不同。与正常组相比,Tyr527位点发生磷酸化的Src在氧糖剥夺4小时组和再灌注6小时组的表达无明显变化,在再灌注12小时组和再灌注24小时组则出现了明显的表达下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。同样与正常组比较,Tyr416位点发生磷酸化的Src蛋白则在氧糖剥夺4小时组的表达无明显变化,而在再灌注6小时组、12小时组和24小时组的表达均出现了上调,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.缺血再灌注损伤引起Src激酶的表达上调;2.缺血再灌注损伤引起Src激酶的活化,与Tyr416位点磷酸化和Tyr527位点的去磷酸化均有关。
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