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第一部分：微泡联合低频超声诱导肝癌细胞凋亡的实验研究 目的： 以低频聚焦超声辐照裸微泡的方法对人肝癌细胞HepG2进行空化治疗，观察细胞的损伤情况。 材料与方法： 1．实验材料 (1)实验材料：HepG2细胞，由浙江大学医学院附属第二医院临床科学研究中心提供；注射用六氟化硫微泡，意大利Bracco公司生产的SonoVue; BD-Annexin V-FITC/PI流式细胞检测试剂盒；CCK-8细胞增殖检测试剂盒；GAPDH、PCNA、Cleaved-Caspase-3、DMEM培养基(GIBCO)，胎牛血清，100U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，75%酒精，台盼蓝染液。 (2)实验仪器：浙江大学创新技术研究院自主研发的低频聚焦超声治疗仪，流式细胞仪，酶标仪，光学显微镜，低速离心机，细胞培养瓶，细胞培养箱，50mL离心管，1mL移液枪，200 μL移液枪，1ml无菌注射器，6孔细胞培养板，96孔细胞培养板。 2．实验方法 将培养好HepG2细胞用0.1%胰蛋白酶及0.1%二乙胺四乙酸(EDTA)消化细胞制成单细胞悬液，每组分别取6×106的细胞平均种于六孔板内，将细胞分为四组：A组：空白对照组，仅注射生理盐水；B组：微泡对照组，仅注射微泡；C组：超声辐照组，仅进行超声辐照；D组：空化治疗组，微泡与超声辐照结合。空化完成后，分别对各组细胞进行光学显微镜观察；细胞增殖实验；流式细胞检测以及电镜观察等。 结果： 光学显微镜下观察可见D组大部分细胞漂浮于培养液表层，细胞碎裂，少部分贴壁生长；而A、B、C三组细胞未见明显异常。CCK-8结果显示：24h、48h、72h D组的OD值明显低于其他三组（P均＜0. 05）。流式细胞结果显示：D组细胞凋亡率明显高于3个对照组。WB结果显示：D组cleaved-Caspase-3表达量明显高于其他三组（P均＜0. 05）；而其PCNA表达量明显低于其他三组（P均＜0. 05）。透射电镜显示：D组肿瘤细胞核固缩、边集明显，线粒体肿胀、脊增殖，粗线内质网肿胀并形成空泡，细胞膜部分溶解。其余三个对照组细胞相对正常。 结论： 低频聚焦超声介导裸微泡的空化效应可诱导HepG2肝癌细胞凋亡。 第二部分：微泡增强低频超声空化效应抑制兔原位肝癌的实验研究 目的： 利用低频聚焦超声联合静脉注射裸微泡的方法治疗兔VX2原位肝癌移植瘤，观察微泡介导的超声惯性空化效应对原位肿瘤的疗效，并探讨其可能的机制。 材料与方法： 1．实验动物与材料 (1)实验动物：VX2荷瘤种兔1只，浙江大学提供。清洁级健康雄性成年新西兰大白兔40只，体重2. 5～3. 5kg，饲养于浙江省实验动物中心动物房，实验过程中均以正常饲料喂养。 (2)实验仪器： ①治疗仪器：采用浙江大学创新技术研究院自主研发的低频聚焦超声治疗仪。 ②超声造影仪器：使用百胜Mylab 90超声造影仪器，超声造影及定位使用LA332线阵探头。 ③超声造影定量分析软件：采用TOMTEC SonoLiver l.1软件。 (3)实验试剂：微泡造影剂为SonoVue六氟化硫微泡（意大利，Bracco公司）其微泡浓度约1～5×108个/ml，PH值约4.5～7.5。麻醉药为3%戊巴比妥钠（Sigma公司）。抗体：CD31抗体(ABcam)， 2．实验方法 (1)选取成功建模的24只VX2原位肝移植瘤模型兔随机分为四组，每组6只：A组：空白对照组，仅注射生理盐水；B组：微泡对照组，仅注射微泡；C组：超声辐照组，生理盐水联合超声辐照治疗；D组：空化治疗组，微泡与超声辐照结合。分别在治疗前，连续三天治疗后第1天、7天、14天、21天行常规超声、超声造影(contrast enhanced ultrasound， CEUS)脱机分析影像学资料，根据二维超声图像测量肿瘤的体积(tumor volume，TV)，并绘制各个时期的肿瘤体积增长曲线；在超声造影图像上分析造影剂灌注的峰值强度(peak intensity，PI)。 (2)治疗后第21天安乐死处死各组实验兔，分离肿瘤组织，部分固定于10%中性福尔马林溶液中，石蜡切片后行组织病理学HE染色；部分固定于30%蔗糖中，冰冻切片后行CD31免疫组化染色，观察肿瘤组织微血管密度(micro vessel density，MVD)。部分肿瘤组织固定于电镜固定液中，行透射电镜(transmission electron mlcroscope，TEM)以观察肿瘤细胞内超微结构的变化。 结果： 1．治疗前各组TV与PI差异均无统计学意义（P均＞0. 05）；治疗后第1、7、14天D组PI明显低于A、B、C组（P均＜0. 05），治疗后7、14、21天D组TV明显小于A、B、C组（P均＜0. 05），而A、B、C三组TV与PI差异均无统计学意义（P均＞0. 05）。 2．HE染色显示，D组肿瘤组织可见大片坏死区，肿瘤血管内有微血栓形成，并可见局部红细胞浸润，而A、B、C三组很少见到上述病理改变。CD31免疫组化显示：D组肿瘤组织MVD明显小于A、B、C组。透射电镜显示：D组肿瘤细胞染色质边集，核膜断裂，细胞质内可见线粒体空泡样改变，A、B、C三组很少见到上述改变，但在细胞质内可见大量不同阶段的自噬小体。 结论： 低频聚焦超声介导裸微泡的空化效应可通过破坏肿瘤血管以及损伤肿瘤细胞抑制兔VX2肿瘤组织的生长。