糖尿病足(diabetic foot，DF)指与下肢远端神经异常和不同程度的周围血管病变相关的足部感染、溃疡、和(或)深层组织破坏，为糖尿病常见慢性并发症之一。由于其发病率高，危害性大，治疗费用高，糖尿病足的防治研究是当今糖尿病领域的热点之一。目前对其发病机制的研究除了血管病变、神经病变以及感染等因素之外，对糖尿病足特征性的慢性难愈性伤口的分子机制的研究也日渐增多。在众多分子机制中，基质金属蛋白酶(MMPs)与糖尿病足关系的研究较为完善和深入。 基质金属蛋白酶家族是一组Zn2+依赖性肽链内切酶，它们能够降解细胞外基质和非基质蛋白。MMP9(92kD)也称明胶酶B，含特有的Ⅳ型胶原样功能域，可降解多种胶原蛋白、弹力蛋白等皮肤基质成分。众多研究发现，在糖尿病完整皮肤组织中MMP9表达量已显著增高；溃疡发生后，伤口组织及伤口渗液中MMP9的含量增高，活性增强；在糖尿病足愈合的过程中，MMP9的升高不仅降解细胞外基质，还加速生长因子、生长因子受体、整合素及其受体的降解，从而加重局部伤口炎症反应，并减慢伤口的愈合。 已证实糖尿病足部组织以及伤口渗液中MMP9表达量增高是造成糖尿病皮肤易损性增加以及伤口难愈的重要因素之一，但MMP9的增多具体由哪些细胞分泌增多所造成，则尚存争议。 综上所述，抑制局部伤口的MMP9的表达可能是加快糖尿病足伤口愈合的方法之一，然而目前尚无MMP9的特异性抑制剂。 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是在生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指将与内源性mRNA编码区同源的双链RNAs(double stranded RNAs，dsRNAs)导入细胞，可高效、特异地使mRNA发生降解而导致基因表达沉默。由于其高效、特异的抑制效果被广泛应用于基础研究。本研究应用RNA干扰技术抑制大鼠皮肤成纤维细胞MMP9合成，探讨其能否作为抑制糖尿病皮肤成纤维细胞中增高MMP9的方法，为后续对MMP9基因沉默对糖尿病足治疗(敷料等)的研究打下基础。 研究目的： 1、定位正常大鼠、糖尿病大鼠以及糖尿病大鼠伤口周围皮肤MMP9分布，并比较各组间MMP9表达量的差异；确认成纤维细胞是否参与糖尿病皮肤及其伤口中MMP9的表达增高及失衡。 2、阳离子脂质体转染siRNA抑制成纤维细胞MMP9基因的表达，筛选出抑制效率最佳siRNA片段。 材料与方法： 1.免疫组化定位MMP9分布 实验分3组：正常SD成年大鼠背部皮肤、STZ法成模的SD糖尿病大鼠(6周)背部皮肤、STZ大鼠背部伤口形成后3天伤口周围皮肤组织，免疫组化对MMP9表达在真、表皮中进行定位，并比较三组表达量的差异。免疫组化(S—P法)操作步骤按说明书进行，切片常规脱蜡水化后，加入过氧化酶阻断溶液阻断内源性过氧化物酶的活性，抗原修复后加入小鼠抗大鼠MMP9的一抗，4℃冰箱过夜(阴性对照不加一抗)后加入生物素标记的第二抗体，室温下孵育后再加入链霉菌抗生素蛋白—过氧化物酶溶液，DAB显色，苏木素复染，继之脱水、透明、封片。染色过程中均设有阴性对照。 2.细胞培养 由第一步确定真皮层成纤维细胞作为后继试验的靶细胞。取一天龄正常SD大鼠背部皮肤分离成纤维细胞，于含10％胎牛血清的DMEM培养液中进行原代细胞培养；取第三代细胞进行细胞鉴定，鉴定内容包括细胞形态观察和细胞波形蛋白的免疫组织化学鉴定。待一瓶细胞接近融合时，以0.25％胰蛋白酶溶液消化传代。选生长状态良好的2～4代细胞进行试验或冻存，冻存细胞标记好细胞名称及时间，以备后期使用。 3.建立高表达MMP9蛋白的成纤维细胞模型 为模拟糖尿病皮肤环境，实验采用高糖与高同型半胱氨酸(homocystein，Hcy)刺激皮肤成纤维细胞高表达MMP9。取2～4代生长良好的细胞进行24小时血清饥饿(0.5％FBS)后，分为三组：正糖组、高糖组、高糖+高Hcy组；分别用含5.5mmol/L葡萄糖10％FBS DMEM培养基、含22mmol/L葡萄糖10％FBS DMEM培养基、含22mmol/L葡萄糖10％FBS+100μmol/L Hcy的DMEM培养基培养6小时。后继用于明胶酶谱法检测上清蛋白的用0.5％FBS低血清培养，其余同上。 4.模型建立后MMP9mRNA水平检测 提取细胞中总RNA后经紫外分光光度计检测纯度和浓度，经电泳法检测完整性。符合要求的总RNA以逆转录－聚合酶链式反应(reverse transcript—polymerase chain reaction，RT—PCR)半定量检测MMP9 mRNA水平，以GAPDH作为内参照。引物设计采用Primer5.0软件。电泳结束后拍照，以Image Quant5.2凝胶图像分析系统进行半定量分析。 5.模型建立后MMP9蛋白水平检测 提取细胞总蛋白质，用MiniBCA法测定蛋白浓度，再通过蛋白质印迹法(Western blot)来测定MMP9蛋白质水平，以GAPDH作为内参照。在暗室中用X光胶片曝光，用Image Quant5.2软件对条带进行密度扫描，以面积×密度代表MMP9蛋白的表达量，以目的蛋白与内参的比值代表目的蛋白相对水平。 6.模型建立后MMP9蛋白酶活性的检测 采用明胶酶谱法检测MMP9酶活性。低血清(0.5％FBS)培养细胞，提取等量细胞的等量上清液，MiniBCA法测定提取物中蛋白质浓度，上样于含1％明胶的SDS—PAGE胶内电泳。电泳结束后用含2.5％Triton X-100的洗脱液室温30分钟洗脱SDS，再用漂洗液漂洗。将漂洗后的凝胶置于含Ca2+、Zn2+孵育液中37℃孵育48小时。孵育后用蒸馏水漂洗凝胶，0.5％考马斯亮蓝染色，蒸馏水漂洗后脱色液脱色至蓝色凝胶上出现被明胶酶消化的透明条带(MMP9:92kDa)。拍照后Image Quant5.2凝胶图像分析系统进行半定量分析。 7.siRNA制备 根据GenBank大鼠MMP9基因(GI:13591992 Locus:NM_031055)已知序列选择靶序列交由公司，四对MMP9siRNA以及阴性和阳性对照由Gene Pharma公司合成。siRNA成品均为已退火的冻干粉，所有siRNA均经过高压液相色谱法(HPLC)纯化，去除尚未配对的单链。使用前需要无RNAased的稀释缓冲液将其溶解为50μM作为母液。 8.优化转染条件 采用阳离子脂质体Lipofectamine2000转染FAM标记的GAPDH siRNA入原代培养正常大鼠皮肤成纤维2～4代细胞(正糖培养：5.5mmol/L葡萄糖)。分9个转染体系，荧光倒置显微镜观察荧光细胞筛选转染率75％以上的转染条件；继以MTT检测各转染条件对成纤维细胞的毒性作用，筛选出其中细胞存活率85％以上的最优转染体系，以之作为下一步实验的转染条件。 9.MMP9 siRNA转染 选生长状态良好的正糖(5.5 mmol/L葡萄糖)培养的2～4代大鼠成纤维细胞，在最优转染条件下转染4对MMP9siRNA.以及相应的阴性对照(通用阴性对照)和阳性对照(GAPDH siRNA)，同时设置空白对照(只加转染试剂)；转染后血清饥饿(0.5％FBS)24小时，之后更换培养基为22mmol/L葡萄糖10％FBS+100μmol/L Hcy的DMEM培养继续6、24、48小时。 10.检测MMP9mRNA水平抑制率 分别于转染后30、48、72小时收集细胞，提取总RNA，RT—PCR检测MMP9siRNA对MMP9mRNA的抑制率；方法同4。 11.检测MMP9蛋白水平抑制率 分别于转染后30、48、72小时收集细胞，提取总蛋白，Weatern blot方法检测MMP9siRNA对MMP9蛋白表达量的抑制率；方法同5。 12.检测MMP9酶活性的抑制率 分别于转染后30、48、72小时收集细胞上清液，明胶酶谱法检测MMP9siRNA对MMP9酶活性水平的抑制率；方法同6。 13.统计学分析 数据资料符合正态分布者用均数±标准差表示，并用SPSS12.0统计软件对所得数据进行分析。两组间均数的比较用非配对t检验；多组间比较用单因素方差分析(one—way ANOVA)，多组间两两比较用LSD。以上实验均在同等条件下重复3次，最终结果取平均值，以P<0.05为差异有显著性。 结论： 1、糖尿病大鼠皮肤成纤维细胞可表达MMP9，伤口周围表达量更高；提示皮肤成纤维细胞作为主要的伤口修复细胞，也参与了糖尿病皮肤(尤其伤口)中MMP9表达量的增高及失衡。 2、本研究选用4对化学合成的MMP9 siRNA，由阳离子脂质体转入大鼠皮肤成纤维细胞后，可有效抑制MMP9的表达及活性；筛选出抑制效率最佳的片段为进一步研究打下基础。