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前言泛素羧基末端水解酶L1 (UCH-L1),又叫蛋白基因产物9.5(PGP9.5),属于泛素羧基末端水解酶家族,参与泛素介导的蛋白质降解途径,其主要作用是当泛素化的底物附着到蛋白酶体后,UCH-L1水解泛素和底物蛋白质间的链,然后底物进入蛋白酶体被降解,而多聚泛素被切割为单体重新参与泛素蛋白酶体的循环,具有泛素连接酶活性及泛素水解酶活性。早期关于UCH-L1的研究集中于它对神经组织以及性别发育的作用,尤其在帕金森病的研究中较多。近年研究表明,UCH-L1的表达有严格的时间和空间特异性,异常表达常常与细胞的恶性转化和肿瘤的发生有关。UCH-L1在多种肿瘤中高表达,在部分肿瘤中其表达与肿瘤浸润深度、分化程度及淋巴结转移有关。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)是细胞内的主要信息传递系统。p38是MAPK家族重要成员之一。它是一种广泛存在于细胞质中的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,可将细胞外信息传递至细胞核中,从而介导细胞产生各种反应。p38通过磷酸化转录因子引起多种相关基因转录,调控活性物质的表达。p38MAPK信号通路参与肿瘤的侵袭和转移以及肿瘤细胞生长和增殖。经研究发现,UCH-L1与p38存在一定关系。非小细胞肺癌中用RNA干扰抑制UCH-L1的表达,能够抑制非小细胞肺癌体内外的转移,抑制p38的激活。在乳腺癌中UCH-L1的表达是否与肿瘤的分化程度以及侵袭转移有关,UCH-L1与p38之间调控关系如何,目前报道较少。材料和方法一、材料(一)临床资料收集80例乳腺癌组织,取自于中国医科大学附属第一医院2002年1月至2008年5月手术切除标本。所有患者术前未经任何治疗。80例乳腺癌组织均为乳腺浸润性导管癌(IDC),按TNM分期标准,Ⅰ-Ⅱ期48例,Ⅲ-Ⅳ期32例。有淋巴结转移33例,无淋巴结转移47例。收集50例外科手术切除新鲜乳腺组织标本,标本取出后立即置-70℃冰冻保存。其中30例为IDC,(有淋巴结转移14例),20例为乳腺纤维腺瘤。(二)细胞系一种乳腺正常上皮细胞系MCF-10A和两种乳腺癌细胞系(MCF-7为低侵袭低转移癌细胞系、MDA-MB-435s为高侵袭高转移癌细胞系)原购自北京协和基础医学院细胞中心,本实验由已有的细胞复苏而得。(三)主要试剂鼠抗人UCH-L1单克隆抗体(sc-58593)购自SANTA CRUZ公司,鼠抗人p-p38单克隆抗体(#9216)购自Cell signaling公司。UCH-L1抑制剂(#662086)购自Merck公司。Transwell小室(孔径8um)购自Corning公司。二、方法(一)免疫组织化学技术80例标本经10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,4μm厚连续切片,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法(Streptavidin-peroxidase, S-P)按说明书行免疫组化染色。UCH-L1稀释比例为1：150,p-p38稀释比例为1：200,以PBS代替一抗作阴性对照,用已知阳性乳腺癌切片作阳性对照。(二)Western blot技术总蛋白从组织、生长到对数期收集的细胞及不同浓度的UCH-L1抑制剂处理24小时后的MDA-MB-435s细胞中提取。用Bradford法测定蛋白浓度。取等量蛋白,进行SDS-PAGE和转印,分别孵育一抗(UCH-L11:400, p-p381:400稀释)4℃过夜,相应二抗(1：4000)37℃孵育,ECL发光,拍照。用表达阳性的PVDF膜剥脱后重新孵育β-actin抗体作为内参。(三)Transwell实验上室加入1:6Matrigel胶制成的人工基底膜后接种总体积200ul的MDA-MB-435s细胞,并加入终浓度分别为0umol、5umol、10umol、20umol的UCH-L1抑制剂。每个药物浓度做3复孔,37℃培养24h后观察。擦掉基底膜上室面的细胞,下室细胞固定后Giemsa染色。400×光镜下随机选择30个视野计数,取其平均数为穿膜细胞数。三、统计学分析应用SPSS 16.0统计软件行数据处理：采用x2检验(不满条件时用Fisher确切概率法)分析各组计数资料,采用Spearman等级相关分析UCH-L1蛋白与p-p38蛋白表达的关系,采用t检验分析Western Blot图像灰度值,transwell穿膜细胞数,用LSD-t检验对各样本均数行两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果一、UCH-L1、p-p38在乳腺癌组织中的表达及其同临床病理参数的关系在80例IDC石蜡标本中,UCH-L1阳性表达42例(52.5%),定位于细胞浆。p-p38阳性表达46例(57.5%),主要定位于细胞核,少量定位于细胞浆。统计学分析显示,UCH-L1蛋白表达和p-p38蛋白表达呈正相关(r=0.397,P=0.000)。两者表达水平均与IDC的TNM分期(P=0.017,P=0.010)、淋巴结转移情况(P=0.033,P=0.021)相关,UCH-L1的表达与组织学分级相关(P=0.032),而p-p38的表达与组织学分级无关(P=0.794),二者与患者年龄(P=0.296,P=0.585),肿瘤大小(P=0.300,P=0.161)无明显相关性。在新鲜乳腺组织中,UCH-L1、p-p38在IDC中的表达高于乳腺纤维腺瘤组(P=0.012,P=0.001),两者的表达水平在Ⅲ—Ⅳ期IDC中高于Ⅰ—Ⅱ期(P=0.014,P=0.002)；在有淋巴结转移的乳腺癌中高于无淋巴结转移患者(P=0.016,P=0.001)：UCH-L1的表达与组织学分级有关(P=0.038),而p-p38的表达与组织学分级无关(P=0.130),二者的表达均与患者的年龄、肿瘤大小无明显相关性(P=0.753, P=0.539; P=0.723, P=0.765)。二、UCH-L1、p-p38在乳腺细胞系中的表达Western blot检测,乳腺上皮细胞系MCF-10A和乳腺癌细胞系MCF-7, MDA-MB-435s中两种蛋白表达水平呈递增趋势。三、UCH-L1抑制剂作用MDA-MB-435s细胞系24h后观察各指标改变UCH-L1抑制剂可以浓度依赖性地下调MDA-MB-435s细胞系中p-p38蛋白表达水平,并能抑制乳腺癌细胞的侵袭转移潜能(P均<0.05)。结论1、UCH-L1、p-p38过表达与IDC的TMN分期、淋巴结转移有关。2、UCH-L1可能通过上调p-p38介导乳腺癌转移。