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水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的粮食作物之一。叶片是其重要的光合器官,水稻叶片中的叶绿体是活跃的代谢中心,通过光合作用将地球上吸收的太阳能转化为化学能并固定CO2,合成碳水化合物后储存于稻谷。叶色突变体广泛存在于植物界中,大量研究表明,叶色突变体是研究叶片发育的理想材料。利用诱变剂EMS(ethyl methane sulfonate)处理籼型水稻保持系西农1B,获得两个稳定遗传的黄绿叶突变体ygl16(yellow-green leaf16)和ygl17(yellow-green leaf17)。本实验对这2个突变体进行了表型鉴定、主要农艺性状调查、光合色素含量和光合特性分析、细胞学观察;利用缙恢10号分别与ygl16和ygl17杂交构建分离群体,开展目标性状的遗传分析、基因定位及图位克隆,利用荧光实时定量PCR(q RT-PCR)对YGL16、YGL17及部分叶绿素代谢途径相关基因进行表达量分析。主要研究结果如下:1.突变体表型及主要农艺性状突变体ygl16和ygl17的叶片从四叶期始均表现出黄绿色、分蘖期植株均开始矮化,且一直持续到成熟。其中,ygl16黄绿色表型从叶尖部逐渐延伸至叶中部,叶基部略微黄化。与野生型相比,两个黄绿叶突变体的株高、二次枝梗数、每穗实粒数、结实率及千粒重均显著或极显著降低。此外,ygl16单株有效穗、穗长和每穗粒数显著或极显著降低;ygl17的第一、二节间长度和每穗总粒数极显著降低。2.突变体的光合特性抽穗期对野生型和突变体(ygl16和ygl17)光合色素含量的分析结果显示,两个突变体叶片的叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)、总叶绿素(Total Chl)和类胡萝卜素(Car)含量较野生型均极显著降低。基于光合参数的分析结果表明,与野生型相比,ygl16和ygl17的光合速率(Pn)均极显著降低;ygl16的气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)均极显著下降,而胞间CO2浓度(Ci)则极显著增加。推测可能是由于气孔导度降低,突变体ygl16摄取CO2进行光合的能力降低,同时蒸腾作用也下降,进而导致了胞间CO2浓度积累。3.突变体细胞超微结构特性细胞超微分析结果显示,野生型叶绿体基粒丰富,基质片层紧密排列,而突变体ygl16和ygl17叶绿体中嗜饿小体增多,基粒堆积密度低,基质片层疏松;且ygl17中叶绿体数目减少,细胞器部分或完全降解。表明两个突变体的叶绿体均遭到破坏。4.突变性状的遗传分析将两个突变体ygl16和ygl17分别与籼稻恢复系缙恢10号(J10)杂交,F1表型正常;F2发生性状分离。其中ygl16与J10获得的F2代中,表型正常单株为2713株,黄绿叶表型单株为866株,二者分离比符合3:1(χ2=1.232<χ20.05,1=3.84);ygl17与J10获得的F2代中,4168株表现正常,1335株表现黄绿叶表型,其分离比也符合3:1(χ2=1.609<χ20.05,1=3.84)。这表明ygl16和ygl17均受一对隐性核基因控制。5.分子定位与候选基因YGL16和YGL17基因均被定位于第2染色体长臂。其中,YGL16定位于SSR标记ZW2-30和F90-52之间约48 kb的区域内,该区间内有5个开放阅读框(ORF)。通过对野生型和ygl16在定位区间内这5个基因测序,序列比对结果显示,编码牻牛儿基牻牛儿基还原酶(LOC_Os02g51080)50k Da的基因在第一个外显子上第470位碱基由G变成T,导致蛋白序列的第157位氨基酸由甘氨酸(Gly)变为缬氨酸(Val)。初步确定基因为牻牛儿基牻牛儿基还原酶(CHL P)基因(LOC_Os02g51080)。YGL17定位于X8-SSR7和RM1342之间,物理距离为467 kb,共含62个注释基因。对定位区间内部分相关基因进行测序并未发现在野生型和突变体ygl17中存在差异,且该区间尚无已报道的叶色相关基因。6.候选基因的表达模式及部分叶绿素代谢相关基因的表达分析利用实时定量PCR检测了YGL16基因的特异性表达情况发现:YGL16在叶片中表达量较高,而在根、茎、叶鞘、幼穗中表达量较低。qRT-PCR分析结果显示:与野生型相比,突变体ygl16和ygl17的PSⅠ编码基因(Psa A、Psa B、Psa C)、PSⅡ编码基因(Psb A、Psb B、Psb C)和细胞色素b6f复合物编码基因(Pet A、Pet B)的表达量均显著下调,类胡萝卜素代谢途径相关酶基因PSY1和PSY2的转录水平也均下调。另外,突变体ygl16中调控叶绿素代谢途径相关基因CHLM、DVR、CAO1和PORA表达量均不同程度降低,其他叶绿素代谢途径基因除HEMA表达量小幅上调外未发生明显变化。突变体ygl17的叶绿素代谢途径基因(DVR、CHLD、CHLI、CHLM)的转录水平不同程度上调,而叶绿素代谢途径基因HEMA、CAO1、PORA转录水平大幅下调。由此我们推测YGL16和YGL17基因突变均会影响光合色素代谢和光合作用相关基因的表达。