极性脂质的质谱分析方法研究及其应用

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本文主要分为四部分:第一部分建立了电喷雾串联三重四级杆质谱的直接进样方法,分析样品中的六类磷脂和硫苷脂的分子种亚类组成;第二部分建立了高效液相色谱和电喷雾串联三重四级杆质谱联用方法,分析样品中神经酰胺、鞘磷脂、葡萄糖神经酰胺和乳糖神经酰胺的分子种亚类组成;第三部分将直接进样分析方法和液质联用分析方法结合在一起,设计自制进样装置及进样程序,实现极性脂质的同时在线分析;第四部分将三文鱼油通过生物酶法转酯化结合到大豆卵磷脂上,合成出含有丰富多烯磷脂的新型大豆卵磷脂,利用已建立的极性脂质在线同时分析方法,分析比较改性前后大豆卵磷脂的分子种差异。最终将新型大豆卵磷脂应用到脂质体的制备中,包裹胶原蛋白,形成脂质体。首先,本文建立了电喷雾串联三重四级杆质谱直接进样方法,对六类磷脂(磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸和磷脂酰甘油)和硫苷脂的分子种亚类组成进行测定。以鼠脑为样本,先利用氯仿/甲醇法提取样品中的脂质,后利用固相萃取小柱富集、纯化极性脂质。样品导入离子源后,在相应的母离子和中性丢失扫描模式下实现一次进样检测分析六类磷脂和硫苷脂的目的。经验证,该方法的提取回收率(82.6%-104.2%)、日间精密度(1.44-3.87)、日内精密度(2.74-5.87)、最低检出限(0.50-0.87ng/ml)和最低定量限(1.5-2.6ng/ml)能够满足复杂生物样本中磷脂和硫苷脂的分析要求。其次,本文建立了高效液相色谱和电喷雾串联三重四级杆质谱联用的方法,对神经酰胺、鞘磷脂、葡萄糖神经酰胺和乳糖神经酰胺的分子种亚类组成进行测定。分析标准品在碰撞诱导活化解离过程中的特征性碎片离子,建立相应的母离子/子离子对数据库。以鼠脑为样本,先利用氯仿/甲醇法提取样品中的脂质,后利用固相萃取小柱富集、纯化极性脂质,将样品注入高效液相色谱系统,对神经酰胺、鞘磷脂、葡萄糖神经酰胺和乳糖神经酰胺进行分离,洗脱物进入质谱,在多反应监测模式的多个时间窗口下,利用已建立的母离子/子离子对实现四种鞘脂分子种的快速实时监测。经验证,该方法的提取回收率(81.5%-104.5%)、日间精密度(1.12-2.25)、日内精密度(2.42-3.81)、最低检出限(0.03-0.08ng/ml)和最低定量限(0.10-0.25ng/ml)能够满足复杂生物样本中鞘脂的分析要求。其后,本文将直接进样分析方法和液质联用分析方法结合在一起,建立了一种极性脂质的在线同时分析方法。设计以针泵注射器、六通阀和三通阀为主体的自动进样装置,先利用针泵注射器将样品直接导入离子源中,在特异性的母离子和中性丢失模式下,完成对六类磷脂和硫苷脂的扫描分析,再将样品导入六通阀的定量环中,最后将一定体积的样品注入液质联用系统,经液相分离后,在多反应监测模式下完成对神经酰胺、鞘磷脂、葡萄糖神经酰胺和乳糖神经酰胺的检测分析。该方法能在40分钟内完成11种极性脂质(300种以上分子种)快速、准确的同时在线分析。本文应用该方法分析了三种不同动物来源(鼠、鸭、三文鱼)脑组织中的极性脂质,得到鼠脑中307种,鸭脑中308种和三文鱼脑中324种极性脂质分子种信息。比较可得,不同动物来源的磷脂差异显著,特别是三文鱼脑中富含鼠脑和鸭脑所不含的多烯磷脂;不同动物来源的鞘脂差异主要表现在含量上,基本的分子种总类相似。最后,本文从三文鱼加工副产品中提取鱼油,利用尿素包合法富集多不饱和脂肪酸,以生物酶法转酯化将其结合到大豆卵磷脂上,形成富含多烯磷脂的新型大豆卵磷脂。设计正交实验,以改性后大豆磷脂中的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的得率为指标,得到最佳合成条件:大豆卵磷脂和鱼油的比例为1:8,磷脂酶的添加量为18%,反应温度为50℃,反应时间为18h,体系中的水分含量为4%。在最佳条件下,大豆卵磷脂的EPA和DHA得率为24.13%。利用已建立的极性脂质在线分析方法,分析改性前后大豆卵磷脂的分子种组成差异,得出大豆卵磷脂中主要成分为磷脂酰胆碱,磷脂酰乙醇胺,磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸。改性后大豆卵磷脂与前者最大的区别为多烯磷脂分子种的增加和溶血性磷脂含量的上升。改性前大豆卵磷脂的不饱和度较低,最主要的磷脂分子种为PL34:2,PL36:4和PL36:3。经过磷脂酶改性后,大豆卵磷脂新增了许多多烯磷脂分子种,占到总量的27.41-37.01%。改性前大豆卵磷脂中溶血性磷脂含量较低(3.52-4.57%),改性后大豆卵磷脂的溶血性磷脂含量增加(26.85-36.01%)。为了延长改性大豆卵磷脂的货架期,本研究考察了不同抗氧化剂对其氧化稳定性的影响,得出2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)为最佳抗氧化剂,添加0.02%BHT的大豆卵磷脂预存货架期可达390天。最终将改性大豆卵磷脂应用到脂质体的制备中,以卵磷脂为成膜材料,包裹胶原蛋白,形成脂质体。设计正交实验,以包封率为指标,得出最佳制备条件:卵磷脂添加量为3mg/ml,蛋白浓度为4mg/ml,水相磷酸缓冲盐PH值为7.0,探针式超声时间为140s。在最佳条件下,脂质体包封率为42.87%,平均粒径为160nm。
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