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实验背景利塞膦酸钠(Risedronate,RIS)是第三代含氮双膦酸盐,主要用于骨质疏松症、骨癌痛及佩吉特病等疾病的治疗。既往研究表明RIS主要通过调节骨代谢紊乱来产生抗炎镇痛作用,但RIS对神经病理性疼痛是否产生镇痛作用尚未见有报道。神经病理性疼痛(Neuropathic pain,NP)是由外周和/或中枢感觉神经系统损伤引起的慢性痛觉过敏和痛觉超敏。之前有研究表明,胶质细胞、p38MAPK信号传导通路的活化参与了NP的发生和发展,其中神经小胶质细胞可分泌多种促炎症细胞因子来产生炎症反应,如IL-1β、IL-6以及TNF-α等。有研究表明,破骨细胞与神经胶质细胞均属于单核吞噬细胞系统,并且同来自于骨髓造血干细胞。Service等人发现在骨癌痛模型中,双膦酸盐减弱了肿瘤诱导的外周和中枢致敏标志物,如星形胶质细胞标志物GFAP,因此我们猜想RIS可能通过抑制胶质细胞、p38 MAPK通路的活化,减少促炎症细胞因子的表达,进而产生镇痛作用。实验目的本实验采用L5脊神经结扎剪断模型模仿神经病理性疼痛,通过皮下注射RIS来探讨RIS对NP的镇痛作用及分子机制;首先通过皮下注射RIS观察大鼠疼痛行为学变化,探讨RIS是否对大鼠NP产生镇痛作用。然后检测神经小胶质细胞标志物OX42、星形细胞标志物GFAP及p38 MAPK受体蛋白的表达变化,探讨胶质细胞及p38 MAPK信号传导通路在RIS与NP的关系中可能产生的作用。检测促炎症细胞因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的表达变化,从而探讨RIS对NP产生抗炎镇痛的机制。实验方法1雄性SD大鼠随机分为6组(n=8):假手术(Sham)组、手术(SNL)组、RIS低剂量治疗[R(L)组]、RIS中剂量治疗组[R(M)组]、RIS高剂量治疗组[R(H)组]、及空白对照(C)组;分别于术前30min至术后7d皮下注射0.1、0.5、1mg/kg RIS,假手术(Sham)组及手术(SNL)组注射等体积无菌生理盐水。于术前1d,术后1、3、5、7、10、14d测定大鼠机械性缩足阈值(MWT)及热缩足潜伏期(TWL);之后根据上述实验结果,另选一批大鼠随机分为2组(n=8):手术(SNL)组及RIS最佳剂量治疗组[R(B)组],给药时间为术后7d至21d,分别于手术前1天和术后1、3、7、8、10、12、14、16、21d对大鼠进行疼痛行为学测试。2雄性SD大鼠随机分为3组(n=3):Sham组、SNL组及R(B)组;其中RIS注射浓度为上述大鼠疼痛行为学测试结果选取的最佳剂量,给药时间为术前30min至术后7d。在术后7d时,将各组大鼠进行取材,检测p-p38蛋白与OX42、GFAP蛋白的表达水平,以及运用免疫荧光双标染色技术检测p-p38蛋白的细胞定位。3雄性SD大鼠随机分为4组(n=4):Sham组、SNL组、R(B)组及C组;给药时间为术前30min至术后7d。在术后7d时,将各组大鼠进行取材,运用Western Blot技术检测p-p38蛋白在各组大鼠脊髓中的表达水平。4雄性SD大鼠随机分为4组(n=6):Sham组、SNL组、R(B)组及C组;给药时间为术前30min至术后7d。在术后7d时,将各组大鼠进行取材,运用酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组大鼠脊髓(SP)及背根神经节(DRG)促炎症细胞因子IL-1β、IL-6以及TNF-α表达水平。实验结果1 RIS可减轻神经损伤后大鼠痛觉超敏及痛觉过敏各组大鼠术前1d MWT和TWL均无明显差异(P>0.05),且与Sham组相比,C组各时间点MWT和TWL均无明显差异(P>0.05)。SNL组、R(L)组、R(M)组及R(H)组在术后各时间点MWT和TWL水平均下调(P<0.05),但R(L)组、R(M)组及R(H)组在术后5、7、10、14d各指标均优于手术组(P<0.05)。且在术后5、7、10、14d时,与R(M)组相比,R(L)组及R(H)组各指标较低(P<0.05)。以上结果说明,RIS可抑制神经损伤后大鼠产生的机械性痛觉超敏和热痛觉过敏。2 RIS可抑制神经损伤后大鼠脊髓背角小胶质细胞的活化在术后7d时,与Sham组相比,SNL组及R(M)组脊髓背角p-p38、OX42、GFAP蛋白表达水平升高(P<0.05);与SNL组比较,R(M)组中p-p38、OX42蛋白表达水平降低(P<0.05);同时免疫荧光双染结果显示,p-p38蛋白只与小细胞标志物OX42共标,而不与神经元标志物NeuN和星形细胞标志物GFAP共标。以上结果说明,RIS可能通过抑制p-p38 MAPK信号转导通路的激活,进而抑制神经小胶质细胞的活化,对神经病理性疼痛产生镇痛作用。3 RIS可通过p38 MAPK信号转导通路介导神经病理性疼痛在术后7d时,大鼠脊髓中,与Sham组比较,SNL组p-p38 MAPK表达水平升高(P<0.05),R(M)组p-p38MAPK表达无明显差异(P>0.05);与SNL组相比,R(M)组p-p38 MAPK表达水平降低(P<0.05)。上述结果再次证明,RIS可能抑制p38 MAPK信号转导通路通路的激活(磷酸化)而对神经病理性疼痛产生镇痛作用。4 RIS可下调神经损伤后大鼠脊髓及背根神经节中促炎症细胞因子的表达水平持续用药7d后,与Sham组比较,SNL组及R(M)组脊髓(SP)及背根神经节(DRG)中促炎症细胞因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的表达均明显上调(P<0.05),但R(M)组中促炎症细胞因子表达水平较SNL组均明显下调(P<0.05)。这说明RIS可能通过抑制胶质细胞分泌的促炎症细胞因子而产生抗炎镇痛作用。实验结论上述结果证明,RIS可通过抑制p38 MAPK信号转导通路的激活(磷酸化),抑制神经小胶质细胞的活化,以及下调促炎症细胞因子的表达水平,从而减轻神经病理性疼痛。