【摘 要】
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麦角甾醇是真菌细胞产生的一种具有重要经济价值的代谢产物,酿酒酵母菌是生产麦角甾醇的重要菌种。酿酒酵母中麦角甾醇生物合成途径是一个极其复杂的过程,本论文以麦角甾醇生
【出 处】
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中国科学院研究生院 中国科学院大学
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麦角甾醇是真菌细胞产生的一种具有重要经济价值的代谢产物,酿酒酵母菌是生产麦角甾醇的重要菌种。酿酒酵母中麦角甾醇生物合成途径是一个极其复杂的过程,本论文以麦角甾醇生物合成相关的甾醇C-24甲基转移酶基因ERG6和甾醇C-8异构酶基因ERG2为研究对象,研究相应酶活性提高对酿酒酵母麦角甾醇生物合成代谢的调控作用。
通过PCR扩增克隆到酿酒酵母甾醇C-8异构酶的编码序列及其终止子序列,以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352为载体,磷酸甘油酸激酶基因启动子PGK1p为上游调控元件,构建ERG2基因高表达的重组表达质粒pPERG2。同时,在实验室已构建的ERG6表达质粒pPERG6的基础上,构建ERG2和ERG6共表达的重组质粒pPERG6-2。将构建好的重组表达质粒转化酿酒酵母单倍体菌株YS58,依据营养缺陷互补筛选到重组菌株YS58(pPERG2)和YS58(pPERG6-2)。同时用空载体质粒YEp352转化酿酒酵母菌株YS58,获得对照菌株YS58(YEp352)。采用紫外分光光度法和气相色谱法分析重组菌株的麦角甾醇含量和甾醇组分含量。
实验结果显示在不同的培养时间,重组菌株YS58(pPERG2)的麦角甾醇含量始终低于对照菌YS58(YEp352),培养36h的重组菌株YS58(pPERG2)的麦角甾醇含量是对照菌的73％；而在重组菌株YS58(pPERG6)中,麦角甾醇和其它甾醇中间体的含量均有不同程度的提高,其中终产物麦角甾醇的含量是对照菌株的1.27倍；在共表达菌株YS58(pPERG6-2)中,麦角甾醇含量是对照菌株YS58(YEp352)的1.41倍,是ERG2单独高表达菌株YS58(pPERG2)的1.92倍,是ERG6单独高表达菌株YS58(pPERG6)的1.12倍。
本研究首次证明甾醇C-24甲基转移酶催化的反应是酿酒酵母麦角甾醇合成代谢途径中的一个重要的限速步骤,该酶活性提高不但补偿了ERG2高表达对甾醇合成的负效应,而且使麦角甾醇含量进一步提高。上述研究结果将为酵母菌麦角甾醇生物合成的代谢工程优化提供重要的理论依据。
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