水稻FT-Like基因OsFTL4的功能研究

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水稻作为重要的粮食作物和经济作物,适宜的生育期对产量影响巨大,开花作为其中的一个重要环节,决定水稻从营养生长向生殖生长的转变。PEBP家族基因在开花调控中发挥着重要作用,其亚家族FT-Like家族基因和TFL1-Like家族基因之间具有拮抗功能,但在进化过程中它们的功能也开始发生分化。目前对于水稻开花的分子生物学机制已经有了一定的研究,发现了许多关键基因和重要调控通路,但还有许多基因的功能和所处调控通路需要我们进一步探索。本研究在已有的拟南芥FT基因和水稻FT-Like基因的研究基础上,选取OsFTL4作为研究对象,探究其在水稻生长发育过程中所发挥的作用。通过构建以广陆矮4号为背景的OsFTL4的CRISPR/Cas9敲除突变体,探究OsFTL4的基因功能,主要研究结果如下:1.在对OsFTL4基因进行扩增时得到了两个不同的转录本,其中一个与国家水稻数据中心公布的序列一样命名为OsFTL4.1,另一个在第2内含子出现可变剪切并引起移码导致转录提前终止,将其命名为OsFTL4.2。亚细胞定位结果显示OsFTL4.1在细胞核和细胞质中都有荧光信号,而OsFTL4.2只在细胞核中有荧光信号,不同转录本在细胞中定位结果不同;表达分析表明,OsFTL4.1和OsFTL4.2在根、茎、嫩叶、老叶、叶鞘、节以及不同发育阶段的穗中都有表达,在节中表达量最高;2.系统进化树结果显示,OsFTL4与RCN具有较高的同源性;3.利用CRISPR/Cas9系统在OsFTL4第一外显子处设计gRNA位点进行敲除,利用农杆菌介导的方法将构建成功的载体导入广陆矮4号获得突变体植株,测序分析后得到两种类型的纯合突变:插入G的单碱基突变和缺失GT的双碱基突变,都属于移码突变,即获得了osftl4敲除突变体。对osftl4突变体与野生型材料相比,开花时间明显提前,在海南提前23天,在扬州提前16天;4.种子萌发实验结果表明OsFTL4参与调控种子的萌发,且受GA和ABA的调控;5.不同浓度激素溶液处理野生型和突变体幼苗,结果显示:无激素处理条件下osftl4突变体的幼苗高度低于野生型,但在10-12mol/L的GA溶液和10-12mol/L的ABA溶液处理后突变体的幼苗高度与野生型无显著差异,表明OsFTL4影响水稻幼苗的形态建成并且受GA和ABA的调控。荧光定量结果表明OsFTL4参与GA通路和ABA通路,对GA和ABA的相关合成酶有负调控作用;6.光周期处理后表达量分析实验表明,OsFTL4参与光周期调控通路,位于OsGI和OsHHd1的下游,受OsGI和OsHd1的调控;在SD条件下,OsFTL4与OsHHd3a之间具有竞争关系;7.干旱和盐处理实验结果显示:野生型幼苗比osftl4幼苗更耐干旱和耐盐,表明OsFTL4参与水稻的抗旱和耐盐调控;8.酵母双杂结果表明:OsGF14e可同时与OsFTL4.1、OsFTL4.2和OsFD1互作,表明它们之间可以形成类似于FAC的复合物;OsGF14g和OsGF14h都不能与OsFD1和OsFTL4.1互作而只与OsFTL4.2互作,说明OsFTL4不同转录本之间发生了功能的分化。
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