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近年来,将目标分析物识别元件和电化学信号转换元件相结合,构建电化学生物传感器受到了研究者们的广泛关注。由于其具易于操作、经济、灵敏、便携和结构简单等优点,已在生物化学分析、临床医学诊断、环境监测及食品质量安全等领域呈现了极大潜在应用价值。此外,具有不同功能和结构的DNA纳米材料因其良好的可编程性、生物相容性和高特异性被广泛应用于电化学生物传感检测平台的构建中。本文主要围绕功能化DNA纳米结构（如i-motif和“Y-形”结构等）并结合多重信号放大方法（如环介导等温扩增技术、酶辅助的循环放大和酶级联催化放大）,旨在构建选择性高、特异性强、低背景信号和高灵敏的电化学生物传感器,并用于不同疾病标志物目标DNA的快速检测。论文主要研究工作包括三部分:1.LAMP反应H+诱导二聚体i-motif转换信号的超灵敏电化学DNA生物传感器基于i-motif结构的转换、DNA扩增和酶剪切循环放大技术,我们构建了一个用于检测甲型流感病毒相关标志物DNA（fDNA）的超灵敏电化学生物传感器。利用fDNA为模板的环介导等温扩增反应过程中产生的氢离子（LAMP-H+）诱导形成二聚体i-motif结构（DiMS）。在本实验中,DiMS作为信号转换器,结合核酸外切酶III（Exo III）辅助的DNA行走,实现对电化学信号的双重放大。首先,当引入对fDNA有依赖性的LAMP-H+时,两个富含胞嘧啶（C）的亲和链（AS1和AS2）通过半质子化的C·CH+碱基配对,形成Di MS结构。其中AS1和AS2未配对的两端可以与保护链（PS）杂交,释放出一条步行腿（W）,然后W与二茂铁标记的发夹探针（Fc-SP）杂交（Fc-SP:W）从而打开Fc-SP。在形成的双链Fc-SP:W中,ExoIII在对应的识别位点进行剪切,这样会使发夹中标记有Fc的片段被剪切掉,从而离开电极表面。同时释放的W可以参与连续循环的行走,使得Fc的电化学信号显著降低,实现对fDNA的超灵敏检测,检测限为0.018 fg·μL-1。这将为生物分子的超灵敏电化学检测,甚至不同疾病的诊断和治疗提供创新的思路。2.邻位诱导DNA组装和酶剪切循环的高效结合构建高灵敏电化学生物传感器我们还设计了一个邻位诱导DNA组装结构作为输出转换器和酶剪切循环作为信号放大器的电化学阻抗式生物传感器。DNA的组装是在Au-Fe3O4磁性微球上通过将阿尔茨海默症相关的生物标记物DNA（tDNA）与两个亲和探针（A1和A2）进行邻位连接而构建的。首先,A1、DNA连接器（L1）和DNA转换探针（TP）结合在磁性微球上,这种结合使A2的部分区域（C2*）靠近双链TP:L1,导致TP被C2*（C2*:L1）取代。在T7核酸外切酶的催化下发生剪切,导致C2*的释放和后续置换TP反应的触发。对应于单个目标物的结合,大量的TP被释放输出,并被电极表面修饰的发夹DNA（NH2-HP）所捕获。经过核酸外切酶III（ExoIII）的循环剪切后,随着pH的降低,剩下的富含C碱基的序列会变为稳定的i-motif结构,由于对[Fe（CN）6]3-/4-的静电吸引力增加,界面间的电子传递阻抗会减小。因此,本文构建的电化学阻抗DNA传感器表现出很高的特异性和灵敏度,检测限为31 fmol·L-1。该策略有望为疾病诊断和生物分析开辟一条新的分析途径。3.“Y-形”DNA纳米结构限域的双酶级联催化可再生电化学生物传感器的构建除了传统的酶剪切循环和DNA扩增技术,酶级联催化反应也可以对信号进行放大。葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP）之间存在级联反应,基于此,我们构建了一种可再生的电化学生物传感器。末端为双巯基的发夹探针（dSH-HP）中互补配对的茎部作为刚性支架,未成对的环部用来杂交。分别将GOx和电活性二茂铁修饰的HRP固载在两条DNA链上（GOx-ES1和Fc@HRP-ES2）。通过阿尔茨海默症相关的生物标记物DNA（aDNA）置换GOx-ES1和核酸外切酶III（ExoIII）辅助的剪切反应来进行循环放大,从而输出了许多的GOx-ES1。GOx-ES1和Fc@HRP-ES2会同时被dSH-HP捕获,杂交形成“Y-形”DNA纳米结构。双酶的级联催化是通过GOx催化的葡萄糖氧化来促成原位生成H2O2和HRP催化H2O2的分解,从而大大的促进了Fc的电子转移,导致其电化学信号显著增强,并获得了超高灵敏度0.22 fmol·L-1。由于dSH-HP的双酶级联反应的独特设计,这种无需封闭剂的策略具有简单且可再生的特点,并且为电化学灵敏测定生物分子开辟了一条新途径。