论文部分内容阅读
背景在临床中,由运动造成的关节软骨损伤,造成关节软骨局部缺损、退变,导致疼痛和关节活动受限,进而进展为骨关节炎。因软骨组织内在愈合能力有限,局部软骨缺损的治疗中,自体细胞移植成为首选方案。目前,尚不能避免传代造成的软骨细胞“去分化”的问题。如何使软骨细胞能在短期内大量扩增以及保持其特性并达到临床需求,业已成为当前急需解决的问题。目的采用Ⅱ型胶原酶消化和软骨组织块培养序贯法进行新西兰大白兔膝关节透明软骨的软骨细胞分离、培养并鉴定。观察成纤维细胞因子-18(FGF18)和小分子药物Kartogenin(KGN)联合干预对软骨细胞的增殖以及对其细胞特性的影响。方法1.获取新西兰兔双侧膝关节并分离透明软骨组织,序贯采用单纯0.2%Ⅱ型胶原酶消化法和组织块培养法进行原代软骨细胞分离、培养,甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光对软骨细胞进行鉴定,并用CCK8实验检测并绘制传代细胞P1-P6软骨细胞生长曲线。用酶联免疫吸附检测法(ELISA)检测P1、P5培养基内Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的含量并计算两者比例关系。2.分别取P1和P5软骨细胞进行实验,筛选FGF18和KGN浓度后,设置FGF18+KGN(浓度分别为:100 ng/ml、10μM)组、FGF18组(100 ng/ml)、KGN组(浓度为10μM)、对照组。分别应用CCK8、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光、细胞划痕实验、酶联免疫吸附检测法(ELISA)以及Western blot检测各实验组软骨细胞的增殖、迁移以及细胞外基质的分泌的改变。结果1.单纯0.2%Ⅱ型胶原酶消化法和软骨组织块培养法序贯应用能成功分离、培养新西兰兔原代软骨细胞;倒置显微镜下观察,软骨细胞呈圆形和多角形,大小均一,增殖分裂活跃。2.甲苯胺蓝染色实验显示序贯法分离的细胞均染色,细胞核呈紫蓝色,细胞外基质呈浅蓝色,胞内、胞外均有紫蓝色颗粒,存在Aggrecan分泌,免疫荧光显示细胞膜及胞浆内均可见Ⅱ型胶原蛋白荧光,提示细胞具有软骨细胞特性,完成了对软骨细胞的鉴定。3.通过CCK8实验,成功绘制P1-P6细胞生长曲线,结果显示自P5以后各代细胞增殖活性降低(P<0.05);ELISA实验对软骨细胞分泌的Ⅰ、Ⅱ胶原蛋白进行定量检测,P1、P5软骨细胞在72小时内在标准培养基内分泌Ⅰ、Ⅱ胶原蛋白含量的比值分别为:3.12±0.37、7.01±0.56(P<0.05)。4.FGF18和KGN联合应用干预软骨细胞,CCK8实验显示FGF18+KGN组促进软骨细胞对数生长期的增殖(P<0.05)。5.甲苯胺蓝染色实验显示FGF18+KGN组软骨细胞内及细胞外染色加深,证实其能促进细胞分泌Aggrecan增加。Ⅱ型胶原免疫荧光实验显示FGF18+KGN组软骨细胞荧光增强,证实Ⅱ型胶原蛋白表达增加。6.细胞划痕实验结果显示FGF18+KGN组愈合率显著增加(P<0.01),具有促进软骨细胞迁移的作用。7.ELISA实验显示FGF18+KGN组软骨细胞培养基内Ⅱ型胶原蛋白含量显著增加(P<0.01),Ⅰ型胶原蛋白含量显著减少(P<0.01),Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白比例发生改变(P<0.01)。8.Western blot实验结果显示FGF18+KGN组具有代表透明软骨组织的软骨细胞特性的Ⅱ型胶原蛋白、SOX9、Aggrecan显著增加(P<0.01),而具有去分化特性的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅹ型胶原蛋白减少(P<0.01)。结论1.单纯0.2%Ⅱ型胶原酶消化法和软骨组织块细胞培养法序贯应用能成功建立软骨细胞分离、扩增、培养体系。2.FGF18和KGN联合应用干预软骨细胞,可促进软骨细胞增殖并保持透明软骨细胞特性。