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癌症已经成为严重威胁人类健康的重大疾病,其发病率和死亡率仍不断增长。肺癌在所有癌症中发病率和死亡率最高。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)作为肺癌最常见的类型,其病程进展快,易复发转移,大多数患者确诊时已处于晚期,五年生存率低。目前肺癌患者的临床治疗主要包括手术、化疗、放疗和分子靶向治疗。手术适应范围有限,化疗和放疗毒性作用大,因此分子靶向治疗的重要地位日益凸显。吉非替尼(Gefitinib,Gef)作为经典的EGFR-TKIs小分子靶向药物,在临床上应用十分广泛,但治疗数月后患者均会发生耐药,导致治疗失败,病情恶化。因此亟待探究克服EGFR-TKIs耐药的机制,制定有效的治疗策略。近年来,随着人们对肿瘤分子生物学和基因组学的深入研究,寻找癌症发生发展过程中新的关键基因,并开发针对这些关键基因的分子靶向治疗有望为克服EGFR-TKIs耐药提供新的治疗策略。人类叉头框(forkhead box,FOX)蛋白家族是一系列进化上高度保守的转录因子,其特征在于具有叉头框或翼形螺旋结构的DNA结合域。FOX蛋白在调控细胞发育、代谢、分化、增殖、凋亡和侵袭迁移等多个环节发挥重要作用。FOXC2、FOXD1和FOXO3等多个FOX蛋白被证实可促进恶性肿瘤的化疗耐药。叉头框C1(forkhead box C1,FOXC1)作为FOXC亚族的重要一员,研究表明其可能通过促进肿瘤细胞的生长、增殖和侵袭迁移等过程,降低乳腺癌、结直肠癌和卵巢癌等肿瘤细胞对药物的敏感性。但是FOXC1是否影响NSCLC的化疗敏感性尚未见报道。本实验室前期研究表明,FOXC1显著增强NSCLC肿瘤干细胞样特性,诱导A549和H1299细胞对多烯紫杉醇和顺铂化疗耐药,说明FOXC1在NSCLC中可作为促癌因子发挥作用。在前期研究工作的基础上,本实验以NSCLC Gef耐药株PC9/G和敏感株PC9作为研究对象,使用慢病毒构建FOXC1低表达和高表达稳转细胞株,并从细胞增殖、细胞凋亡、迁移和侵袭等细胞生物学过程探究FOXC1对NSCLC细胞Gef敏感性的影响及其作用机制,拓展我们对EGFRTKIs耐药的认识,以期为克服NSCLC对Gef耐药的分子靶向治疗提供新的理论基础。本研究分为以下两个部分:第一部分FOXC1对PC9/G和PC9细胞吉非替尼敏感性的影响目的:探究FOXC1对PC9/G和PC9细胞Gef敏感性的影响。方法:1)使用慢病毒构建FOXC1低表达和高表达稳转细胞株,Western Blot法检测FOXC1蛋白表达变化;2)CCK-8法检测FOXC1低表达和高表达后,Gef对细胞活力的影响;3)克隆形成实验检测细胞增殖的变化,以及Gef对细胞增殖的影响;4)流式细胞术(FCM)检测凋亡细胞比例的变化,以及Gef对凋亡细胞比例的影响;5)使用Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力的变化,以及Gef对细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:(1)FOXC1表达降低增强PC9/G细胞对Gef的敏感性。1)与对照细胞PC9/G-LV-sh Control相比,FOXC1低表达稳转细胞PC9/G-LV-sh FOXC1的FOXC1蛋白表达量显著降低(P<0.001);2)FOXC1表达降低增强Gef对PC9/G细胞活力的抑制,降低Gef的IC50值(P<0.05);3)抑制PC9/G细胞的增殖能力,增强Gef对PC9/G细胞增殖的抑制作用;4)增加PC9/G细胞的凋亡细胞比例(P<0.01),增强Gef诱导的凋亡细胞比例的增加(P<0.05);5)降低PC9/G细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01),增强Gef对PC9/G细胞迁移和侵袭能力的抑制作用(P<0.01)。(2)FOXC1表达升高降低PC9细胞对Gef的敏感性。1)与对照细胞PC9-LVControl相比,FOXC1高表达稳转细胞PC9-LV-FOXC1的FOXC1蛋白表达量显著升高(P<0.001);2)FOXC1表达升高降低Gef对PC9细胞活力的抑制,增加Gef的IC50值(P<0.05);3)增强PC9细胞的增殖能力,降低Gef对PC9细胞增殖的抑制作用;4)降低PC9细胞的凋亡细胞比例(P<0.05),抑制Gef诱导的凋亡细胞比例的增加(P<0.05);5)增强PC9细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01),减弱Gef对PC9细胞迁移和侵袭能力的抑制作用(P<0.05)。结论:FOXC1表达降低可抑制PC9/G细胞增殖,促进细胞凋亡,降低细胞的侵袭迁移能力,增强PC9/G细胞对Gef的敏感性。FOXC1表达升高可促进PC9细胞增殖,抑制细胞凋亡,增强细胞的侵袭迁移能力,降低PC9细胞对Gef的敏感性。提示FOXC1参与调控NSCLC细胞对Gef的耐药。第二部分FOXC1影响PC9/G和PC9细胞吉非替尼敏感性的机制研究目的:探究FOXC1调控PC9/G和PC9细胞对Gef敏感性的相关分子机制。方法:Western Blot法检测FOXC1低表达和高表达分别对相关蛋白表达的影响:凋亡蛋白cleaved caspase-3和促凋亡蛋白BIM,抗凋亡蛋白Bcl-2和促存活蛋白Survivin;侵袭转移相关蛋白N-cadherin、vimentin、MMP9和E-cadherin;ABC转运蛋白家族ABCG2和ABCB5。结果:(1)与对照细胞PC9/G-LV-shControl相比,FOXC1低表达稳转细胞PC9/GLV-sh FOXC1的cleaved caspase-3和BIM表达增多(P<0.01,P<0.001),而Bcl-2和Survivin表达减少(P<0.01,P<0.001);间质标志物N-cadherin和vimentin表达减少(P<0.01,P<0.01),MMP9表达减少(P<0.01),而上皮标志物Ecadherin表达增多(P<0.001);ABC转运体家族蛋白ABCG2和ABCB5表达均显著降低(P<0.01,P<0.01)。(2)与对照细胞PC9-LV-Control相比,FOXC1高表达稳转细胞PC9-LV-FOXC1的cleaved caspase-3和BIM表达减少(P<0.01,P<0.01),而Bcl-2和Survivin表达升高(P<0.01,P<0.01);N-cadherin和vimentin表达增加(P<0.01,P<0.001),MMP9表达增加(P<0.001),而E-cadherin表达减少(P<0.01);ABCG2和ABCB5表达均显著升高(P<0.001,P<0.001)。结论:FOXC1通过调节凋亡相关蛋白表达水平(cleaved caspase-3、BIM、Bcl-2和Survivin)抑制NSCLC细胞凋亡;调节上皮和间质标志物相关蛋白表达水平(E-cadherin、N-cadherin、vimentin和MMP9)增强细胞的侵袭迁移能力;促进ABC转运体蛋白表达(ABCG2和ABCB5)增加药物外排,减少细胞内药物蓄积,从而降低NSCLC细胞对Gef的敏感性。